Inducir la epilepsia postraumática en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática difusa repetitiva

Summary

Este protocolo sistemático describe un nuevo modelo animal de epilepsia postraumática después de una lesión cerebral traumática leve repetitiva. La primera parte detalla los pasos para la inducción de lesiones cerebrales traumáticas usando un modelo de caída de peso modificado. La segunda parte proporciona instrucciones sobre el enfoque quirúrgico para sistemas de adquisición de datos electroencefalográficos monocanal y multicanal.

Abstract

La lesión cerebral traumática (TBI) es una de las principales causas de epilepsia adquirida. La TBI puede resultar en una lesión cerebral focal o difusa. La lesión focal es el resultado de fuerzas mecánicas directas, a veces penetrando a través del cráneo, creando una lesión directa en el tejido cerebral. Estos son visibles durante las imágenes cerebrales como áreas con contusión, laceración y hemorragia. Las lesiones focales inducen la muerte neuronal y la formación de cicatrices gliales y están presentes en el 20% a 25% de todas las personas que incurren en un TBI. Sin embargo, en la mayoría de los casos de TBI, las lesiones son causadas por fuerzas de aceleración-desaceleración y posterior cizallamiento tisular, lo que resulta en daño difuso no focal. Una subpoblación de pacientes con TBI continúa desarrollando epilepsia postraumática (TEP) después de un período de latencia de meses o años. Actualmente, es imposible predecir qué pacientes desarrollarán TEP, y las convulsiones en pacientes con TEP son difíciles de controlar, lo que requiere más investigación. Hasta hace poco, el campo se limitaba a sólo dos modelos animales/roedores con convulsiones post-traumáticas espontáneas validadas, ambos presentando grandes lesiones focales con pérdida masiva de tejido en la corteza y a veces estructuras subcorticales. A diferencia de estos enfoques, se determinó que la TBI difusa inducida mediante un modelo de caída de peso modificado es suficiente para iniciar el desarrollo de convulsiones convulsivas y no convulsivas espontáneas, incluso en ausencia de lesiones focales o pérdida de tejido. Al igual que los pacientes humanos con epilepsia postraumática adquirida, este modelo presenta un período de latencia después de la lesión antes de la aparición de la convulsión. En este protocolo, la comunidad recibirá un nuevo modelo de epilepsia postraumática, detallando cómo inducir TBI difuso no lesional seguido de monitoreo continuo de animales videoelectroencefalográficos a largo plazo en el transcurso de varios meses. Este protocolo detallará el manejo de animales, el procedimiento de caída de peso, la colocación de electrodos para dos sistemas de adquisición y los desafíos frecuentes encontrados durante cada uno de los pasos de la cirugía, el monitoreo postoperatorio y la adquisición de datos.

Introduction

Cada año, TBI afecta a unos 60 millones de personas en todo el mundo. Las personas afectadas tienen un mayor riesgo de desarrollar epilepsia, que puede manifestarse años después de la lesión inicial. Aunque los TBI graves se asocian con un mayor riesgo de epilepsia, incluso la TBI leve aumenta la probabilidad de que un individuo desarrolle epilepsia^1,2,3,4. Todos los TBI se pueden clasificar como focales, difusos o una combinación de ambos. La lesión cerebral difusa, presente en muchos TMI, si no en todos, es el resultado de tejidos cerebrales de diferentes densidades que se cortan entre sí debido a la desaceleración de la aceleración y las fuerzas de rotación. Por definición, la lesión difusa sólo se produce de forma aislada en lesiones cerebrales leves/concusivas no penetrantes, en las que no se pueden ver lesiones cerebrales en las exploraciones por tomografía computarizada⁵.

Actualmente hay dos problemas críticos en el manejo de pacientes que tienen, o están en riesgo de, desarrollar epilepsia post-traumática (TEP). La primera es que una vez que la ETE se ha manifestado, las convulsiones son resistentes a los medicamentos antiepilépticos disponibles (DeA)⁶. En segundo lugar, los DEA son igualmente ineficaces para prevenir la epileptogénesis, y no existen enfoques terapéuticos alternativos eficaces. Para hacer frente a este déficit y encontrar mejores dianas terapéuticas y candidatos para el tratamiento, será necesario explorar nuevos mecanismos celulares y moleculares en la raíz de PTE^6.

Una de las características destacadas de la epilepsia postraumática es el período latente entre el evento traumático inicial y la aparición de convulsiones espontáneas, no provocadas y recurrentes. Los eventos que ocurren dentro de esta ventana temporal son un foco natural para los investigadores, ya que esta ventana de tiempo podría permitir el tratamiento y la prevención de la ETE por completo. Los modelos animales se utilizan más comúnmente para esta investigación porque ofrecen varios beneficios distintos, no menos importante de los cuales es que el monitoreo continuo de pacientes humanos sería a la vez poco práctico y costoso en tales períodos potencialmente largos de tiempo. Además, los mecanismos celulares y moleculares en la raíz de la epileptogénesis sólo se pueden explorar en modelos animales.

Se prefieren modelos animales con convulsiones postraumáticas espontáneas y epilepsia sobre los modelos en los que las convulsiones son inducidas después de TBI por medios menos relevantes fisiológicamente, como por chemoconvulsantes o estimulación eléctrica aguda, crónica o por leña. Los modelos espontáneos de convulsiones postraummáticas prueban cómo TBI modifica la red cerebral saludable que conduce a la epileptogénesis. Los estudios con estimulación adicional después de tAT evalúan cómo la exposición a TBI reduce el umbral de convulsiones y afecta la susceptibilidad a las convulsiones. Las ventajas de los modelos animales con convulsiones inducidas químicamente o con estimulación eléctrica están en el ensayo de los mecanismos específicos de refractoridad a los DEA y la eficacia de los DEA existentes y nuevos. Sin embargo, el grado de pertinencia y traducción de estos datos a los seres humanos puede ser ambiguo⁷ debido a lo siguiente: 1) los mecanismos de incautación pueden ser diferentes de los inducidos por TBI por sí solo; 2) no todos estos modelos conducen a convulsiones espontáneas⁷; 3) las lesiones creadas por el propio agente convulsivo, con la cánula necesaria para su parto, o estimulando la colocación de electrodos en estructuras de profundidad (por ejemplo, el hipocampo o la amígdala) ya pueden causar un aumento de la susceptibilidad a las convulsiones e incluso potenciales de campo epilepciforme del hipocampo^7. Además, algunos agentes convulsivos (es decir, ácido kainic) producen lesiones y esclerosis directas del hipocampo, que no es típica después de la TBI difusa.

Hasta hace poco, sólo existían dos modelos animales de epilepsia postraumática: impacto cortical controlado (CCI, focal) o lesión por percusión fluida (FPI, focal y difusa)⁸. Ambos modelos resultan en lesiones focales grandes junto con pérdida de tejido, hemorragia y gliosis en roedores^8. Estos modelos imitan la epilepsia postraumática inducida por lesiones focales grandes. Un estudio reciente demostró que el TBI difuso repetido (3x) es suficiente para el desarrollo de convulsiones espontáneas y epilepsia en ratones, incluso en ausencia de lesiones focales^9,añadiendo un tercer modelo de ETE de roedores con convulsiones recurrentes espontáneas confirmadas. Este nuevo modelo imita los cambios celulares y moleculares inducidos por la TBI difusa, representando mejor a la población humana con TMI leves y conmovedores. En este modelo, el período latente de tres semanas o más antes de la aparición de la convulsión y la aparición de convulsiones tardías, espontáneas y recurrentes permite investigar las causas profundas de la epileptogénesis postraumática, probar la eficacia de los enfoques preventivos y los nuevos candidatos terapéuticos después de la aparición de la convulsión, y tiene potencial para el desarrollo de biomarcadores de epileptogénesis postraumática porque aproximadamente la mitad de los animales desarrollan epilepsia postraumática.

La elección del modelo animal para el estudio de la epilepsia postraumática depende de la cuestión científica, el tipo de lesión cerebral investigada y qué herramientas se utilizarán para determinar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes. En última instancia, cualquier modelo de epilepsia postraumática debe demostrar tanto la aparición de convulsiones espontáneas después de TBI como un período de latencia inicial en un subconjunto de animales TBI, porque no todos los pacientes que incurren en un TBI van a desarrollar epilepsia. Para ello, en este protocolo se utiliza la electroencefalografía (EEG) con adquisición simultánea de vídeo. Comprender los aspectos técnicos detrás del hardware y los enfoques de adquisición de datos es fundamental para una interpretación precisa de los datos. Los aspectos críticos del hardware incluyen el tipo de sistema de grabación, el tipo de electrodos (tornillo o cable de alambre) y el material del que están hechos, la adquisición de vídeo sincronizado (como parte del sistema EEG o de terceros) y las propiedades del sistema informático. Es imperativo establecer los parámetros de adquisición adecuados en cualquier tipo de sistema dependiendo del objetivo del estudio, eventos EEG de interés, método de análisis adicional y sostenibilidad del almacenamiento de datos. Por último, debe tenerse en cuenta el método de configuración de electrodos (montaje), ya que cada uno tiene ventajas y desventajas y afectará a la interpretación de los datos.

Este protocolo detalla cómo utilizar el modelo de caída de peso Marmarou modificado^10,11 para inducir lesiones difusas que resultan en convulsiones espontáneas, no provocadas y recurrentes en ratones, describe enfoques quirúrgicos para adquirir un EEG de vídeo continuo y multicanal y multicanal mediante montaje monopolar, bipolar o mixto.

Protocol

Todos los procedimientos animales descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Virginia Tech y de conformidad con la “Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio” de los Institutos Nacionales de Salud . 1. Protocolo de manipulación de animales NOTA: Este protocolo está destinado a habituar los animales ordenados de un vendedor a la instalación después de la llegada y condiciona…

Representative Results

El protocolo descrito aquí describe el método de inducción de una lesión difusa de forma aislada (por ejemplo, en ausencia de una lesión focal) utilizando un modelo de ratón de TBI difuso repetitivo(Figura 1). La Figura 1A representa el dispositivo de caída de peso y sus componentes(Figura 1A, a1-a5) utilizados para la inducción de TBI en este modelo y pasos cruciales durante el procedimient…

Discussion

A diferencia de los modelos CCI y FPI que inducen lesiones focales o difusas, el modelo de TBI difuso repetitivo descrito en este protocolo permite la inducción de lesiones difusas en ausencia de lesión cerebral focal y no requiere aberturas del cuero cabelludo o craneal y la inflamación asociada. Un beneficio adicional de la ausencia de craneectomía en este modelo es que permite no sólo implantar los electrodos para la grabación crónica continua del EEG, sino también la creación de una ventana craneal adelgazad…

Materials

0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB