Indusere posttraumatisk epilepsi i en musemodell av repeterende diffus traumatisk hjerneskade

Summary

Denne systematiske protokollen beskriver en ny dyremodell av posttraumatisk epilepsi etter repeterende mild traumatisk hjerneskade. Den første delen detaljer skritt for traumatisk hjerneskade induksjon ved hjelp av en modifisert vekt fall modell. Den andre delen gir instruksjoner om kirurgisk tilnærming for en- og flerkanals elektroencefalografiske datainnsamlingssystemer.

Abstract

Traumatisk hjerneskade (TBI) er en ledende årsak til ervervet epilepsi. TBI kan resultere i en fokal eller diffus hjerneskade. Fokal skade er et resultat av direkte mekaniske krefter, noen ganger penetrerer gjennom kraniet, og skaper en direkte lesjon i hjernevevet. Disse er synlige under hjerneavbildning som områder med kontusjon, kutting og blødning. Fokale lesjoner induserer nevronal død og glial arrdannelse og er tilstede hos 20%−25% av alle mennesker som pådrar seg en TBI. Men i de fleste TBI tilfeller, skade er forårsaket av akselerasjon-retardasjon krefter og påfølgende vev klipping, noe som resulterer i ikke-fokal, diffus skade. En underpopulasjon av TBI-pasienter fortsetter å utvikle posttraumatisk epilepsi (PTE) etter en ventetid på måneder eller år. For tiden er det umulig å forutsi hvilke pasienter som vil utvikle PTE, og anfall hos PTE-pasienter er utfordrende å kontrollere, noe som krever videre forskning. Inntil nylig var feltet begrenset til bare to dyre-/gnagermodeller med validerte spontane posttraumatiske anfall, som begge presenterer med store fokale lesjoner med massivt vevstap i cortex og noen ganger subkortikale strukturer. I motsetning til disse tilnærmingene ble det fastslått at diffus tbi indusert ved hjelp av en modifisert vektdråpemodell er tilstrekkelig til å initiere utvikling av spontane konvulsive og ikke-konvulsive anfall, selv i fravær av fokale lesjoner eller vevstap. I likhet med menneskelige pasienter med ervervet posttraumatisk epilepsi, presenterer denne modellen med en ventetid etter skade før anfall utbruddet. I denne protokollen vil samfunnet bli utstyrt med en ny modell av posttraumatisk epilepsi, som beskriver hvordan man induserer diffus ikke-lesjonelt TBI etterfulgt av kontinuerlig langsiktig video-elektroencefalografisk dyreovervåking i løpet av flere måneder. Denne protokollen vil detalj dyr håndtering, vekt fall prosedyre, elektrode plassering for to oppkjøpssystemer, og hyppige utfordringer oppstått under hvert av trinnene i kirurgi, postoperativ overvåking, og datainnsamling.

Introduction

Hvert år påvirker TBI anslagsvis 60 millioner mennesker over hele verden. Berørte individer har høyere risiko for å utvikle epilepsi, noe som kan manifestere år etter den første skaden. Selv om alvorlige TBIer er forbundet med en høyere risiko for epilepsi, øker selv mild TBI en persons sjanse til å utvikle epilepsi^1,2,3,4. Alle TBO-er kan klassifiseres som fokal, diffuse eller en kombinasjon av begge. Diffus hjerneskade, tilstede i mange om ikke alle TBIer, er et resultat av hjernevev av forskjellige tettheter som skjærer mot hverandre på grunn av akselerasjonsretardasjon og rotasjonskrefter. Per definisjon oppstår diffus skade bare isolert i mild /hjernerystelse, ikke-gjennomtrengende hjerneskade, der ingen hjerneskader er synlige på beregnede tomografiskanninger⁵.

Det er for tiden to kritiske problemer i behandling av pasienter som har, eller er i fare for, å utvikle posttraumatisk epilepsi (PTE). Den første er at når PTE har manifestert, anfall er resistente mot tilgjengelige antiepileptiske legemidler (AEDs)⁶. For det andre er AEDer like ineffektive for å forhindre epileptogenese, og det finnes ingen effektive alternative terapeutiske tilnærminger. For å løse dette underskuddet og finne bedre terapeutiske mål og kandidater til behandling, vil det være nødvendig å utforske nye cellulære og molekylære mekanismer ved roten av PTE⁶.

En av de fremtredende trekk ved posttraumatisk epilepsi er den latente perioden mellom den første traumatiske hendelsen og utbruddet av spontane, uprovoserte, tilbakevendende anfall. Hendelsene som oppstår i dette tidsmessige vinduet er et naturlig fokus for forskere, fordi dette tidsvinduet kan tillate behandling og forebygging av PTE helt. Dyremodeller brukes oftest til denne forskningen fordi de tilbyr flere forskjellige fordeler, ikke minst av dem er at kontinuerlig overvåking av menneskelige pasienter vil være både upraktisk og kostbart over slike potensielt lange tidsspenn. I tillegg kan cellulære og molekylære mekanismer ved roten av epileptogenesis bare utforskes i dyremodeller.

Dyremodeller med spontane posttraumatiske anfall og epilepsi foretrekkes fremfor modeller der anfall induseres etter TBI med mindre fysiologisk relevante midler, for eksempel ved chemoconvulsants eller elektrisk stimulering akutt, kronisk eller ved opptenning. Spontane posttraumatiske anfallsmodeller tester hvordan TBI endrer det sunne hjernenettverket som fører til epileptogenese. Studier som bruker ekstra stimulering etter TBI vurderer hvordan eksponering for TBI reduserer anfallsterskelen og påvirker mottakelighet for anfall. Fordelene med dyremodeller med anfall indusert kjemisk eller med elektrisk stimulering er i testing av de spesifikke mekanismene for refractoriness til AEDer og effekten av eksisterende og nye AEDer. Likevel kan graden av relevans og oversettelse av disse dataene til mennesker være^{tvetydige 7} på grunn av følgende: 1) anfallsmekanismer kan være forskjellig fra de som induseres av TBI alene; 2) ikke alle disse modellene fører til spontane anfall⁷; 3) lesjoner skapt av konvulsiv tupp middel selv, med kanylen som kreves for levering, eller ved å stimulere elektrodeplassering i dybdestrukturer (f.eks. hippocampus eller amygdala) kan allerede forårsake økt anfallsfølsomhet og til og med hippocampal epileptiformfeltpotensialer⁷. Videre produserer noen konvulsive midler (dvs. kainic syre) direkte hippocampal lesjoner og sklerose, som ikke er typisk etter diffus TBI.

Inntil nylig, bare to dyr modeller av posttraumatisk epilepsi eksisterte: kontrollert kortikal innvirkning (CCI, fokal) eller væske perkusjon skade (FPI, fokal og diffus)⁸. Begge modellene resulterer i store fokale lesjoner sammen med vevstap, blødning og gliose hos gnagere⁸. Disse modellene etterligner posttraumatisk epilepsi indusert av store fokale lesjoner. En fersk studie viste at gjentatt (3x) diffus TBI er tilstrekkelig for utvikling av spontane anfall og epilepsi hos mus selv i fravær av fokale lesjoner⁹, og legger til en tredje gnager PTE-modell med bekreftede spontane tilbakevendende anfall. Denne nye modellen etterligner cellulære og molekylære endringer indusert av diffuse TBI, som bedre representerer den menneskelige befolkningen med milde, hjernerystelser. I denne modellen, latent perioden på tre uker eller mer før anfall utbruddet og fremveksten av sent, spontane, tilbakevendende anfall gjør det mulig å undersøke de grunnleggende årsakene til posttraumatisk epileptogenesis, teste effekten av forebyggende tilnærminger og nye terapeutiske kandidater etter anfall utbruddet, og har potensial for utvikling av biomarkører av posttraumatisk epileptogenesis fordi omtrent halvparten av dyrene utvikler posttraumatisk epilepsi.

Valget av dyremodell for studiet av posttraumatisk epilepsi avhenger av det vitenskapelige spørsmålet, typen hjerneskade undersøkt, og hvilke verktøy som skal brukes til å bestemme de underliggende cellulære og molekylære mekanismene. Til syvende og sist må enhver modell av posttraumatisk epilepsi demonstrere både fremveksten av spontane anfall etter TBI og en innledende ventetid i en undergruppe av TBI-dyr, fordi ikke alle pasienter som pådrar seg en TBI, fortsetter å utvikle epilepsi. For å gjøre dette brukes elektroencefalografi (EEG) med samtidig videooppkjøp i denne protokollen. Det er avgjørende å forstå de tekniske aspektene bak datainnsamlingsmaskinvare og tilnærminger for nøyaktig datatolkning. De kritiske maskinvareaspektene inkluderer typen opptakssystem, type elektroder (skrue eller ledningsledning) og materiale de er laget av, synkronisert videoanskaffelse (som en del av EEG-systemet eller tredjeparten), og egenskapene til datasystemet. Det er viktig å sette de riktige oppkjøpsparametrene i alle typer systemer avhengig av studiemål, EEG-hendelser av interesse, videre analysemetode og bærekraft av datalagring. Til slutt må metoden for elektrodekonfigurasjon (montasje) vurderes, da hver har fordeler og ulemper og vil påvirke datatolkningen.

Denne protokollen beskriver hvordan du bruker den modifiserte Marmarou vektfallmodell^10,11 for å indusere diffus skade som resulterer i spontan, uprovosert, tilbakevendende anfall hos mus, beskriver kirurgiske tilnærminger for å skaffe seg en enkelt- og flerkanals kontinuerlig, og synkronisert video EEG ved hjelp av monopolar, bipolar eller blandet montasje.

Protocol

Alle dyreprosedyrer som er beskrevet i denne protokollen ble utført i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) av Virginia Tech og i samsvar med National Institutes of Health’s ‘Guide for care and use of Laboratory Animals’ . 1. Protokoll for håndtering av dyr MERK: Denne protokollen er ment å habituate dyr bestilt fra en leverandør til anlegget etter ankomst og for å kondisjonere dem til å bli håndtert av eksperimentereren. Dette forbedr…

Representative Results

Protokollen som er skissert her beskriver metoden for induksjon av en diffus skade isolert (f.eks. i fravær en fokal lesjon) ved hjelp av en musemodell av repeterende diffus TBI (Figur 1). Figur 1A viser vektfallenheten og komponentene ( figur1A, a1−a5) som brukes til induksjon av TBI i denne modellen og avgjørende trinn under prosedyren (Figur 1B, b1−b5</…

Discussion

I motsetning til CCI- og FPI-modeller som induserer enten fokus eller kombinasjon av fokal og diffus skade, gjør modellen av repeterende diffus TBI beskrevet i denne protokollen mulighet for induksjon av diffus skade i fravær av fokal hjerneskade og krever ikke hodebunn eller kraniale åpninger og tilhørende betennelse. En ekstra fordel med fraværet av kraniektomy i denne modellen er at det gjør det mulig å ikke bare implantere elektrodene for kronisk kontinuerlig EEG-opptak, men også etableringen av et tynnet kra…

Materials

0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB