Et semi-High-gennemløb Imaging metode og data visualisering Toolkit til at analysere C. elegans embryonale udvikling
Summary
Dette arbejde beskriver en semi-High-gennemløb protokol, der tillader samtidige 3D time-lapse Imaging af embryogenese i 80 – 100 C. elegans embryoner i en enkelt overnight kørsel. Derudover er billedbehandling og visualiseringsværktøjer inkluderet for at strømline dataanalyse. Kombinationen af disse metoder med brugerdefinerede reporter stammer muliggør detaljeret monitorering af embryogenese.
Abstract
C. elegans er det førende system til systematisk analyse af celle skæbne specifikation og morfogenetiske hændelser under fosterudvikling. En udfordring er, at embryogenese dynamisk udfolder sig over en periode på omkring 13 h; denne halve dag lange tidshorisont har begrænset omfanget af eksperimenter ved at begrænse antallet af embryoner, der kan imaged. Her beskriver vi en protokol med halv højt gennemløb, der muliggør samtidig 3D-tidsforskudt billeddannelse af udvikling i 80 – 100 embryoner ved moderat tidsopløsning, fra op til 14 forskellige forhold, i en enkelt overnight kørsel. Protokollen er ligetil og kan gennemføres af ethvert laboratorium med adgang til et mikroskop med punkt besøgs kapacitet. Nytten af denne protokol er demonstreret ved at bruge den til at billedet to specialbyggede stammer udtrykker fluorescerende markører optimeret til at visualisere centrale aspekter af kimlag specifikation og morphogenesis. For at analysere data, et brugerdefineret program, der beskærer individuelle embryoner ud af et bredere synsfelt i alle kanaler, z-trin og tidspunkter og gemmer sekvenser for hvert embryo i en separat TIFF stak blev bygget. Programmet, som omfatter en brugervenlig grafisk brugergrænseflade (GUI), strømliner databehandling ved isolering, forbehandling, og ensartet orientere individuelle embryoner som forberedelse til visualisering eller automatiseret analyse. Leveres også er en ImageJ makro, der samler individuelle embryo data i en multi-panel fil, der viser maksimal intensitet fluorescens projektion og lysfelt billeder for hvert embryo på hvert tidspunkt. De protokoller og værktøjer, der er beskrevet heri, blev valideret ved at bruge dem til at karakterisere embryonale udvikling efter knock-down af 40 tidligere beskrevne udviklingsmæssige gener; denne analyse visualiserede tidligere annoterede udviklingsmæssige fænotyper og afslørede nye. Sammenfattende, dette arbejde detaljer en semi-High-gennemløb Imaging metode kombineret med en beskæring program og ImageJ visualisering værktøj, der, når det kombineres med stammer udtrykker informative fluorescerende markører, i høj grad accelererer eksperimenter til at analysere embryonale udvikling.
Introduction
C. elegans embryo er et vigtigt model system for mekanistisk cellebiologi og analyse af celle skæbne specifikation og morfogenetiske hændelser kørsel embryonale udvikling1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Til dato, meget af karakteriseringen af både cellulære-niveau begivenheder og celle skæbne specifikation i embryonet er opnået ved hjælp af relativt høj tidsmæssig opløsning en-til-en-tid billeddannelse eksperimenter (dvs. erhvervelse hver 10 – 100 s) af embryoner, der udtrykker fluorescerende markører. Selv om det er velegnet til begivenheder på rækkefølgen af sekunder til snesevis af minutter, denne fremgangsmåde bliver teknisk begrænsende for karakterisering af længere processer, på rækkefølgen af timer til dage. Embryonale udvikling fra første spaltning til slutningen af forlængelse tager omkring 10 h. På denne tid-skala, semi-High-gennemløb metoder, der ville give mulighed for samtidige lavere tidsopløsning billeddannelse (dvs. erhvervelse på 5 – 20 minutters tidsintervaller) af større kohorter af embryoner, fra forskellige betingelser, ville åbne op for en ny række eksperimenter; f. eks. muliggøre systematiske, omfattende Screenings bestræbelser og analyse af et tilstrækkeligt antal embryoner til sammenligning af følgerne af molekylære forstyrrelser.
Her beskriver vi en semi-High-gennemløb metode til overvågning C. elegans embryo Genesis, der muliggør samtidig 3D time-lapse billeddannelse af udvikling i 80 – 100 embryoner, fra op til 14 forskellige betingelser, i en enkelt overnight køre. Protokollen er ligetil at gennemføre og kan udføres af ethvert laboratorium med adgang til et mikroskop med punkt besøgs muligheder. De vigtigste trin i denne protokol er skitseret i figur 1. Kort sagt dissekeret embryoner fra gravid voksne, der udtrykker fluorescerende markører af interesse og overfører unge embryoner (2 – 8 celle trin) til brønde af en 384-brønd plade til billeddannelse. I dette format tragter den relativt lille brønd størrelse embryoner ind i et snævert område, hvilket letter identifikationen af felter, der indeholder flere embryoner til tidsforskudt billeddannelse. For at opretholde nogenlunde synkrone udvikling på tværs af kohorten af embryoner udføres dissektioner i kølede medier, og pladen holdes på is, hvilket forhindrer en betydelig udvikling i det time lange dissektions tidsvindue. Pladen overføres til mikroskopet, og embryonerne optages i et temperaturkontrolleret rum om natten, med 20 minutters tidsintervaller, ved hjælp af en 60x olie fordybning 1,35 NA linse, for at indsamle hele z-området i 2 μm trin. 50 felter, der hver indeholder mellem 1 – 5 embryoner, er inddelt i en enkelt overnight kørsel. Afhængigt af det ønskede eksperiment kan tids opløsningen forøges (f. eks. med 5 – 10 minutters intervaller) ved proportionalt at formindske antallet af felter med afbildet.
Med denne protokol genererer selv en enkelt overnight kørsel en betydelig mængde data (80 – 100 embryoner spredt ud over 50 felter), og større eksperimenter kan hurtigt blive uoverskuelige med hensyn til dataanalyse. For at lette behandling, visualisering og strømlinet analyse af disse data blev et program bygget til at beskære og orientere embryoner og udføre forbehandlings trin (valgfrit) og en ImageJ makro, der samler dataene for at forenkle visningen. Disse programmer kan bruges til at behandle billeder indsamlet ved hjælp af konventionelle tilgange, da de er uafhængige af billedbehandlings metoden, der kun kræver et enkelt lysfelt-fly. Det første program tager i et 4d felt, der indeholder flere embryoner (GUI option eller kildekode embryoCrop.py) eller flere 4d felter, der indeholder flere embryoner (screenCrop.py), stramt afgrøder embryoner og orienterer dem i en anterior-posterior konfiguration. Disse programmer giver også brugerne mulighed for at udføre baggrunds subtraktion, drift korrektion og dæmpning korrektion. De resulterende filer er ensartet forbehandlet, stramt beskåret TIFF stakke for hvert embryo, der kan ændres til automatiseret billedanalyse. For at gøre det enklere at se alle embryoner for hver betingelse, en ImageJ makro (OpenandCombine_embsV2. IJM) blev skrevet, som samler alle embryoner fra en given betingelse i en enkelt TIFF stack og arrays lysfelt billeder og maksimal intensitet projektion farve ( RGB) overlejringer, side om side, for hvert embryo. Metoderne blev valideret ved at bruge dem til at karakterisere embryonale udvikling efter knock-down af 40 tidligere beskrevne udviklingsmæssige gener i et par specialbyggede stammer, der udtrykker fluorescerende markører optimeret til at visualisere centrale aspekter af kimlag specifikation og morfogenesis10,11. Sammen, den semi-høj gennemløb embryo Imaging protokol og billedbehandling værktøjer vil muliggøre højere prøve antal eksperimenter og storstilet screening indsats med henblik på at forstå udviklingsmæssige processer. Desuden vil disse stammer også give et effektivt middel til at undersøge virkningerne af molekylære forstyrrelser på embryogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbejde beskriver en række værktøjer og metoder, der blev udviklet for at muliggøre større indsats for at profilere funktionen af gener i embryonale udvikling i C. elegans. Vores semi-High-gennemløb metode tillader 3D time-lapse billeddannelse af embryonale udvikling ved 20 min opløsning for 80 – 100 embryoner i et enkelt eksperiment. Mens denne protokol kan tilpasses til brug med enhver ønsket markør stamme (r), dette arbejde demonstrerer potentialet i metoden ved hjælp af to brugerdefinerede …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O. blev støttet af National Institute of General Medical Sciences-sponsoreret University of California San Diego institutionel forskning og akademisk karriereudvikling Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). E.kr. og K.O. blev støttet af Ludwig Institute for Cancer Research, som også gav dem forskningsmidler, der blev brugt til at støtte dette arbejde. Vi er taknemmelig for Andrew Chisholm for hans råd i de tidlige faser af dette projekt, Ronald Biggs for bidrag til dette projekt efter den indledende metode udviklingsfasen, og Dave Jenkins og Andy Shiau for støtte og adgang til den lille molekyle opdagelse koncernens High-Content Imaging System.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
- Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
- Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
- Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
- Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
- Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
- Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Dryad Digital Repository. , (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Zenodo. , (2018).
- . Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. 발생학. 100 (1), 64-119 (1983).
- Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
- Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
- Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
- Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).
