Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development
Summary
Diese Arbeit beschreibt ein semi-high-throughput-Protokoll, das eine gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Embryogenese in 80–100 C. elegans Embryonen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Darüber hinaus sind Bildverarbeitungs- und Visualisierungstools enthalten, um die Datenanalyse zu optimieren. Die Kombination dieser Methoden mit kundenspezifischen Reporterstämmen ermöglicht eine detaillierte Überwachung der Embryogenese.
Abstract
C. elegans ist das führende System zur systematischen Analyse der Zellschicksalsspezifikation und morphogenetischen Ereignisse während der embryonalen Entwicklung. Eine Herausforderung besteht darin, dass sich die Embryogenese über einen Zeitraum von etwa 13 h dynamisch entfaltet; diese halbtägige Zeitskala hat den Umfang der Experimente eingeschränkt, indem die Anzahl der Embryonen, die abgebildet werden können, begrenzt wurde. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit halbhohem Durchsatz, das die gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Entwicklung bei 80–100 Embryonen bei moderater Zeitauflösung von bis zu 14 verschiedenen Bedingungen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Das Protokoll ist einfach und kann von jedem Labor mit Zugang zu einem Mikroskop mit Punktbesuchskapazität implementiert werden. Der Nutzen dieses Protokolls wird demonstriert, indem es verwendet wird, um zwei kundenspezifische Stämme abzubilden, die fluoreszierende Marker ausdrücken, die optimiert sind, um schlüsselwichtige Aspekte der Keimschichtspezifikation und Morphogenese zu visualisieren. Um die Daten zu analysieren, wurde ein benutzerdefiniertes Programm erstellt, das einzelne Embryonen aus einem breiteren Sichtfeld in allen Kanälen, Z-Schritten und Zeitpunkten schneidet und die Sequenzen für jeden Embryo in einen separaten Tiff-Stack speichert. Das Programm, das eine benutzerfreundliche grafische Benutzeroberfläche (GUI) umfasst, optimiert die Datenverarbeitung durch Isolierung, Vorverarbeitung und gleichmäßige Ausrichtung einzelner Embryonen zur Vorbereitung auf Visualisierung oder automatisierte Analyse. Ebenfalls mitgeliefert wird ein ImageJ-Makro, das einzelne Embryodaten in eine Multi-Panel-Datei zusammenfasst, die maximale Fluoreszenzprojektion und Hellfeldbilder für jeden Embryo zu jedem Zeitpunkt anzeigt. Die hier beschriebenen Protokolle und Werkzeuge wurden validiert, indem sie zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung nach dem Abbau von 40 zuvor beschriebenen Entwicklungsgenen verwendet wurden; Diese Analyse visualisierte zuvor kommentierte Entwicklungsphänotypen und zeigte neue. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine halbhohe Durchsatz-Bildgebungsmethode in Verbindung mit einem Zuschneideprogramm und einem ImageJ-Visualisierungstool, das in Kombination mit Stämmen, die informative Fluoreszenzmarker exdrücken, Experimente zur Analyse erheblich beschleunigt. embryonale Entwicklung.
Introduction
Der C. elegans Embryo ist ein wichtiges Modellsystem für die mechanistische Zellbiologie und Analyse der Zellschicksalsspezifikation und morphogenetischen Ereignisse, die die embryonale Entwicklung antreiben1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Bis heute wurde ein Großteil der Charakterisierung sowohl von Ereignissen auf zellulärer Ebene als auch von Zellschicksalsspezifikationen im Embryo mit relativ hohen zeitlichen Auflösungsexperimenten erreicht, die fluoreszierende Marker. Obwohl dieser Ansatz für Ereignisse in der Größenordnung von Sekunden bis zehn Minuten gut geeignet ist, wird er technisch einschränkend für die Charakterisierung längerer Prozesse in der Reihenfolge von Stunden zu Tagen. Die embryonale Entwicklung von der ersten Spaltung bis zum Ende der Dehnung dauert etwa 10 h. Bei dieser Zeitskala würden halbhohe Durchsatzmethoden, die eine gleichzeitige Bildgebung mit niedrigerer Zeitauflösung (d. h. Erfassung in 5–20 min Zeitintervallen) größerer Kohorten von Embryonen aus unterschiedlichen Bedingungen ermöglichen würden, eine neue Reihe von Experimenten eröffnen; z. B. die Ermöglichung systematischer groß angelegter Screening-Bemühungen und die Analyse einer ausreichenden Anzahl von Embryonen für Vergleiche der Folgen molekularer Störungen.
Hier beschreiben wir eine methode mit einem halbhohen Durchsatz zur Überwachung der C. elegans embryogenese, die die gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Entwicklung in 80–100 Embryonen von bis zu 14 verschiedenen Bedingungen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Das Protokoll ist einfach zu implementieren und kann von jedem Labor mit Zugang zu einem Mikroskop mit Punktbesuchsfähigkeiten durchgeführt werden. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind in Abbildung 1beschrieben. Kurz gesagt, Embryonen werden von gravid Erwachsenen seziert, die fluoreszierende Marker von Interesse ausdrücken und junge Embryonen (2–8 Zellstadium) in Brunnen einer 384-Well-Platte für die Bildgebung übertragen. In diesem Format trichtert die relativ kleine Brunnengröße Embryonen in einen engen Bereich, was die Identifizierung von Feldern mit mehreren Embryonen für die Zeitraffer-Bildgebung erleichtert. Um die ungefähr synchrone Entwicklung über die Kohorte von Embryonen hinweg aufrechtzuerhalten, werden Sezierungen in gekühlten Medien durchgeführt und die Platte auf Eis gehalten, was eine signifikante Entwicklung während des stundenlangen Sezierzeitfensters verhindert. Die Platte wird auf das Mikroskop übertragen und Embryonen werden in einem temperaturgeregelten Raum über Nacht gefilmt, in 20 min Zeitintervallen, mit einer 60x Öl-Tauchlinse 1,35 NA-Linse, um den gesamten Z-Bereich in 2 m Schritten zu sammeln. Fünfzig Felder, die jeweils zwischen 1 und 5 Embryonen enthalten, werden in einem einzigen Nachtlauf abgebildet. Je nach gewünschtem Experiment könnte die Zeitauflösung erhöht werden (z. B. Bildgebung in 5–10 min Intervallen), indem die Anzahl der abgebildeten Felder proportional verringert wird.
Mit diesem Protokoll erzeugt selbst ein einziger Nachtlauf eine signifikante Datenmenge (80–100 Embryonen, die über 50 Felder verteilt sind) und größere Experimente können in Bezug auf die Datenanalyse schnell unüberschaubar werden. Um die Verarbeitung, Visualisierung und Rationalisierung dieser Daten zu erleichtern, wurde ein Programm entwickelt, um Embryonen auszuschneiden und auszurichten und Vorverarbeitungsschritte durchzuführen (optional), und ein ImageJ-Makro, das die Daten kompiliert, um die Anzeige zu vereinfachen. Diese Programme können verwendet werden, um Bilder zu verarbeiten, die mit konventionellen Ansätzen gesammelt wurden, da sie unabhängig von der Bildgebungsmethode sind und nur eine einzige Hellfeldebene erfordern. Das erste Programm nimmt ein 4D-Feld auf, das mehrere Embryonen (GUI-Option oder Quellcode embryoCrop.py) oder mehrere 4D-Felder enthält, die mehrere Embryonen enthalten (screenCrop.py), schneidet Embryonen fest und orientiert sie in einer vorderen Posterior-Konfiguration. Diese Programme geben Benutzern auch die Möglichkeit, Hintergrundsubtraktion, Driftkorrektur und Dämpfungskorrektur durchzuführen. Die resultierenden Dateien sind einheitlich vorverarbeitete, eng zugeschnittene Tiff-Stacks für jeden Embryo, die für die automatisierte Bildanalyse geändert werden können. Um das Anzeigen aller Embryonen für jede Bedingung zu vereinfachen, wurde ein ImageJ-Makro (OpenandCombine_embsV2.ijm) geschrieben, das alle Embryonen aus einem bestimmten Zustand zu einem einzigen Tiff-Stack zusammenfügt und hellfeldbildende Bilder und eine Projektionsfarbe mit maximaler Intensität ( RGB) Überlagerungen, nebeneinander, für jeden Embryo. Die Methoden wurden validiert, indem sie verwendet wurden, um die embryonale Entwicklung nach dem Abbau von 40 zuvor beschriebenen Entwicklungsgenen in einem Paar von kundenspezifischen Stämmen zu charakterisieren, die fluoreszierende Marker exdrücken, die optimiert sind, um Schlüsselaspekte der Keimschicht zu visualisieren. Spezifikation und Morphogenese10,11. Zusammen werden das semi-hohe Durchsatz-Embryo-Bildgebungsprotokoll und bildverarbeitende Werkzeuge höhere Probenzahlenexperimente und groß angelegte Screening-Bemühungen ermöglichen, die darauf abzielen, Entwicklungsprozesse zu verstehen. Darüber hinaus werden diese Stämme auch ein effizientes Mittel zur Untersuchung der Auswirkungen molekularer Störungen auf die Embryogenese bieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit beschreibt eine Reihe von Werkzeugen und Methoden, die entwickelt wurden, um größere Anstrengungen zu ermöglichen, die Funktion von Genen in der embryonalen Entwicklung in C. eleganszu profilieren. Unsere Methode mit hohem Durchsatz ermöglicht eine 3D-Zeitraffer-Bildgebung der embryonalen Entwicklung bei einer Auflösung von 20 min für 80–100 Embryonen in einem einzigen Experiment. Während dieses Protokoll für die Verwendung mit beliebigen Markerstämmen angepasst werden kann, zeigt diese A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O. wurde vom National Institute of General Medical Sciences gesponserten University of California San Diego Institutional Research and Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524) unterstützt. A.D. und K.O. wurden vom Ludwig-Institut für Krebsforschung unterstützt, das ihnen auch Forschungsgelder zur Unterstützung dieser Arbeit zur Verfügung stellte. Wir danken Andrew Chisholm für seinen Rat in den frühen Phasen dieses Projekts, Ronald Biggs für Beiträge zu diesem Projekt nach der ersten Phase der Methodenentwicklung und Dave Jenkins und Andy Shiau für unterstützung und Zugang zur Small Molecule Discovery das high-Content-Bildgebungssystem der Gruppe.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
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