एक अर्द्ध उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग विधि और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन टूलकिट का विश्लेषण करने के लिए C. elegans भ्रूणीय विकास
Summary
यह काम एक अर्द्ध उच्च throughput प्रोटोकॉल है कि एक साथ 3 डी समय चूक 80-100 C. elegans भ्रूण में एक ही रात भर चलाने में भ्रूण की इमेजिंग की अनुमति देता है का वर्णन करता है. साथ ही, छवि संसाधन और दृश्यावलोकन उपकरण डेटा विश्लेषण को कारगर बनाने के लिए शामिल किए गए हैं। कस्टम रिपोर्टर उपभेदों के साथ इन तरीकों का संयोजन भ्रूणजनन की विस्तृत निगरानी में सक्षम बनाता है।
Abstract
सी elegans भ्रूण विकास के दौरान सेल भाग्य विनिर्देश और morphogenetic घटनाओं के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए प्रमुख प्रणाली है. एक चुनौती यह है कि भ्रूणजनन गतिशील रूप से लगभग 13 ज की अवधि में प्रकट होता है; इस आधे दिन के समय के पैमाने पर भ्रूण है कि छवि की जा सकती है की संख्या सीमित द्वारा प्रयोगों के दायरे को सीमित किया है. यहाँ, हम एक अर्द्ध उच्च throughput प्रोटोकॉल है कि एक साथ 3 डी समय चूक मध्यम समय संकल्प पर 80-100 भ्रूण में विकास के इमेजिंग के लिए अनुमति देता है का वर्णन, अप करने के लिए 14 विभिन्न स्थितियों से, एक ही रात में चलाने में. प्रोटोकॉल सीधा है और बिंदु पर जाकर क्षमता के साथ एक माइक्रोस्कोप के उपयोग के साथ किसी भी प्रयोगशाला द्वारा लागू किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता यह दो कस्टम निर्मित उपभेदों रोगाणु परत विनिर्देश और morphogenesis के प्रमुख पहलुओं कल्पना करने के लिए अनुकूलित फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त करने के लिए उपयोग करके प्रदर्शन किया है. डेटा का विश्लेषण करने के लिए, एक कस्टम प्रोग्राम है कि फसलों अलग-अलग भ्रूण सभी चैनलों में देखने की एक व्यापक क्षेत्र से बाहर, z कदम, और timepoints और एक अलग झगड़ा ढेर में प्रत्येक भ्रूण के लिए दृश्यों बचाता है बनाया गया था. कार्यक्रम है, जो एक उपयोगकर्ता के अनुकूल चित्रमय यूजर इंटरफेस (GUI) भी शामिल है, visualization या स्वचालित विश्लेषण के लिए तैयार करने में अलग-अलग भ्रूण अलग अलग, पूर्व प्रसंस्करण, और समान रूप से उन्मुख द्वारा डेटा प्रसंस्करण को कारगर बनाता है। इसके अलावा आपूर्ति की एक ImageJ मैक्रो है कि एक बहु पैनल फ़ाइल है कि अधिकतम तीव्रता फ्लोरोसेंट प्रक्षेपण और प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक भ्रूण के लिए brightfield छवियों को प्रदर्शित करता है में अलग-अलग भ्रूण डेटा compiles है. प्रोटोकॉल और उपकरण यहाँ वर्णित उन्हें 40 पहले वर्णित विकासजीन के दस्तक के बाद भ्रूण विकास की विशेषता के लिए का उपयोग करके मान्य किया गया; इस विश्लेषण पहले एनोटेट विकासphenotypes कल्पना और नए लोगों से पता चला. सारांश में, यह काम एक अर्द्ध उच्च थ्रूपुट इमेजिंग विधि एक फसल कार्यक्रम और ImageJ दृश्य उपकरण के साथ युग्मित विवरण है कि, जब जानकारीपूर्ण फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त उपभेदों के साथ संयुक्त, बहुत प्रयोगों का विश्लेषण करने के लिए accelerates भ्रूणीय विकास.
Introduction
सी एलिगेंस भ्रूण यंत्री कोशिका जीव विज्ञान के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है और कोशिका भाग्य विनिर्देश और morphogenetic घटनाओं भ्रूण विकास ड्राइविंग के विश्लेषण1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. तारीख करने के लिए, दोनों सेलुलर स्तर की घटनाओं और भ्रूण में सेल भाग्य विनिर्देश की विशेषता के बहुत अपेक्षाकृत उच्च लौकिक संकल्प एक पर एक समय इमेजिंग प्रयोगों का उपयोग कर प्राप्त किया गया है (यानी, अधिग्रहण हर 10-100 s) भ्रूण व्यक्त की फ्लोरोसेंट मार्करों. हालांकि अच्छी तरह से मिनट के दसियों करने के लिए सेकंड के आदेश पर घटनाओं के लिए अनुकूल है, इस दृष्टिकोण तकनीकी रूप से अब प्रक्रियाओं की विशेषता के लिए सीमित हो जाता है, दिन के लिए घंटे के आदेश पर. भ्रूण विकास पहले दरार से दीर्घीकरण के अंत तक के बारे में लेता है 10 ज. इस समय पैमाने पर, अर्द्ध उच्च throughput तरीकों कि एक साथ कम समय संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति होगी (यानी, भ्रूण के बड़े सहगण के 5-20 मिनट समय अंतराल पर अधिग्रहण), विभिन्न स्थितियों से, प्रयोगों की एक नई श्रृंखला खुल जाएगा; उदाहरण के लिए, व्यवस्थित बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग प्रयासों और आणविक क्षोभ के परिणामों की तुलना के लिए भ्रूण की पर्याप्त संख्या के विश्लेषण को सक्षम करने.
यहाँ, हम सी elegans भ्रूणजनन की निगरानी के लिए एक अर्द्ध उच्च throughput विधि का वर्णन है कि 80-100 भ्रूण में विकास के एक साथ 3 डी समय चूक इमेजिंग सक्षम बनाता है, अप करने के लिए 14 विभिन्न स्थितियों से, एक ही रात में चलाने के लिए. प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए सीधा है और बिंदु पर जाकर क्षमताओं के साथ एक माइक्रोस्कोप के उपयोग के साथ किसी भी प्रयोगशाला द्वारा किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के प्रमुख कदमचित्र 1में दिए गए हैं। संक्षेप में, भ्रूण ब्याज की फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त करने और इमेजिंग के लिए एक 384 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं के लिए युवा भ्रूण (2-8 सेल चरण) हस्तांतरण gravid वयस्कों से विच्छेदन कर रहे हैं. इस प्रारूप में, अपेक्षाकृत छोटे अच्छी तरह से आकार कीप एक संकीर्ण क्षेत्र में भ्रूण, जो समय चूक इमेजिंग के लिए कई भ्रूण युक्त क्षेत्रों की पहचान की सुविधा. भ्रूण के सहगण भर में मोटे तौर पर तुल्यकालिक विकास बनाए रखने के लिए, विच्छेदन ठंडा मीडिया में प्रदर्शन कर रहे हैं और थाली बर्फ पर आयोजित किया जाता है, जो घंटे भर विच्छेदन समय खिड़की के दौरान महत्वपूर्ण विकास को रोकता है. प्लेट माइक्रोस्कोप को स्थानांतरित कर दिया है और भ्रूण एक तापमान नियंत्रित कमरे में रात भर फिल्माया जाता है, 20 मिनट के समय अंतराल पर, एक 60x तेल विसर्जन 1.35 एनए लेंस का उपयोग कर, 2 $m चरणों में पूर्ण z सीमा इकट्ठा करने के लिए. पचास खेतों, प्रत्येक 1-5 भ्रूण के बीच युक्त, एक ही रात में चलाने में छवि रहे हैं. वांछित प्रयोग के आधार पर, समय रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 5-10 मिनट के अंतराल पर इमेजिंग) आनुपातिक रूप से छविवाले फ़ील्ड की संख्या कम करके.
इस प्रोटोकॉल के साथ, यहां तक कि एक भी रात भर चलाने के डेटा का एक महत्वपूर्ण राशि उत्पन्न करता है (80-100 भ्रूण 50 से अधिक क्षेत्रों में फैले) और बड़े प्रयोगों जल्दी से डेटा विश्लेषण के संबंध में अप्रबंधनीय हो सकता है. इस डेटा के प्रसंस्करण, दृश्यऔर सुव्यवस्थित विश्लेषण को सुविधाजनक बनाने के लिए, भ्रूण को क्रॉप करने और ओरिएंट करने और प्री-प्रोसेसिंग चरण (वैकल्पिक) और एक ImageJ मैक्रो जो देखने को सरल बनाने के लिए डेटा को संकलित करने के लिए एक प्रोग्राम बनाया गया था। इन कार्यक्रमों के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण का उपयोग कर एकत्र छवियों को संसाधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में वे इमेजिंग विधि से स्वतंत्र हैं, केवल एक ही brightfield विमान की आवश्यकता होती है. पहला कार्यक्रम एक 4D फ़ील्ड में लेता है जिसमें एकाधिक भ्रूण (GUI विकल्प या स्रोत कोड embryoCrop.py) या कई 4D फ़ील्ड होते हैं जिनमें कई भ्रूण (screenCrop.py), कसकर फसलें भ्रूण होती हैं और उन्हें पूर्वकाल-पोस्टर कॉन्फ़िगरेशन में उन्मुख करती हैं। ये प्रोग्राम उपयोगकर्ताओं को पृष्ठभूमि घटाव, प्रवाह सुधार, और क्षीणन सुधार करने का विकल्प भी देते हैं. परिणामस्वरूप फ़ाइलें समान रूप से पूर्व संसाधित कर रहे हैं, कसकर प्रत्येक भ्रूण है कि स्वचालित छवि विश्लेषण करने के लिए संशोधन कर रहे हैं के लिए झगड़ा ढेर. यह आसान प्रत्येक शर्त के लिए सभी भ्रूण को देखने के लिए बनाने के लिए, एक ImageJ मैक्रो (OpenandCombine-embsV2.iJm) लिखा गया था, जो एक भी झगड़ा ढेर में एक शर्त से सभी भ्रूण assembles और arrays brightfield छवियों और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण रंग ( RGB) ओवरले, पक्ष द्वारा साइड, प्रत्येक भ्रूण के लिए. तरीकों को उनका उपयोग करके पुष्टि की गई थी जो रोगाणु-परत के प्रमुख पहलुओं की कल्पना करने के लिए अनुकूलित फ्लोरोसेंट मार्करों को व्यक्त करने वाले कस्टम-निर्मित उपभेदों की एक जोड़ी में 40 पहले से वर्णित विकास जीनों की दस्तक के बाद भ्रूण विकास की विशेषता है। विनिर्देश और रूपजनन10,11. साथ में, अर्द्ध उच्च थ्रूपुट भ्रूण इमेजिंग प्रोटोकॉल और छवि प्रसंस्करण उपकरण विकासात्मक प्रक्रियाओं को समझने के उद्देश्य से उच्च नमूना संख्या प्रयोगों और बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग प्रयासों को सक्षम करेंगे। इसके अलावा, इन उपभेदों भी भ्रूणजनन पर आणविक क्षोभ के प्रभाव की जांच के लिए एक कुशल साधन प्रदान करेगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
यह कार्य उन औजारों और विधियों के एक समूह का वर्णन करता है जो सी एलिगेंसमें भ्रूणीय विकास में जीनों के कार्य को परिपादित करने के लिए बड़े पैमाने पर प्रयासों को सक्षम करने के लिए विकसित किए गए थे . हमार?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O. कैलिफोर्निया सैन डिएगो संस्थागत अनुसंधान और शैक्षणिक कैरियर विकास पुरस्कार के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान के संस्थान द्वारा प्रायोजित विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था (NIH/IRACDA K12 GM068524). ए.डी. और के.ओ. कैंसर अनुसंधान के लिए लुडविग संस्थान द्वारा समर्थित थे, जो भी उन्हें इस काम का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल अनुसंधान धन के साथ प्रदान की. हम इस परियोजना के प्रारंभिक चरणों में उनकी सलाह के लिए एंड्रयू Chisholm के आभारी हैं, रोनाल्ड Biggs प्रारंभिक विधि विकास चरण के बाद इस परियोजना के लिए योगदान के लिए, और डेव Jenkins और एंडी Shiau समर्थन और छोटे अणु डिस्कवरी के लिए उपयोग के लिए समूह के उच्च सामग्री इमेजिंग प्रणाली.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
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