Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans
Summary
Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l’imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l’analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell’embriogenesi.
Abstract
C. elegans è il sistema principale per l’analisi sistematica delle specifiche del destino cellulare e degli eventi morfogenetici durante lo sviluppo embrionale. Una sfida è che l’embriogenesi si sviluppa dinamicamente in un periodo di circa 13 h; questa scala cronologica di mezza giornata ha limitato la portata degli esperimenti limitando il numero di embrioni che possono essere immagine. Qui, descriviamo un protocollo semi-alto-velocità che consente l’imaging time-lapse 3D simultaneo dello sviluppo in 80-100 embrioni a risoluzione temporale moderata, da un massimo di 14 condizioni diverse, in una singola esecuzione notturna. Il protocollo è semplice e può essere implementato da qualsiasi laboratorio con accesso a un microscopio con capacità di visita del punto. L’utilità di questo protocollo è dimostrata usandola per immaginare due ceppi personalizzati che esprimono marcatori fluorescenti ottimizzati per visualizzare gli aspetti chiave della specifica e della morfogenesi dello strato germinale. Per analizzare i dati, è stato costruito un programma personalizzato che ritaglia singoli embrioni da un campo visivo più ampio in tutti i canali, i passi z e i punti temporali e salva le sequenze per ogni embrione in una pila tiff separata. Il programma, che include un’interfaccia utente grafica (GUI) intuitiva, semplifica l’elaborazione dei dati isolando, pre-elaborazione e orientando uniformemente i singoli embrioni in preparazione per la visualizzazione o l’analisi automatizzata. Viene fornita anche una macro ImageJ che compila i dati dei singoli embrioni in un file multi-pannello che visualizza la proiezione della fluorescenza massima e immagini del campo luminoso per ogni embrione in ogni punto di tempo. I protocolli e gli strumenti descritti nel presente file sono stati convalidati utilizzandoli per caratterizzare lo sviluppo embrionale a seguito di 40 geni dello sviluppo descritti in precedenza; questa analisi ha visualizzato fenotipi dello sviluppo precedentemente annotati e ne ha rivelato di nuovi. In sintesi, questo lavoro descrive in dettaglio un metodo di imaging semi-alto-velocità accoppiato con un programma di ritaglio e uno strumento di visualizzazione ImageJ che, se combinato con ceppi che esprimono marcatori fluorescenti informativi, accelera notevolmente gli esperimenti da analizzare sviluppo embrionale.
Introduction
L’embrione di C. elegans è un importante sistema modello per la biologia delle cellule meccanicistiche e l’analisi delle specifiche del destino cellulare e degli eventi morfogenetici che guidano lo sviluppo embrionale1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Fino ad oggi, gran parte della caratterizzazione sia degli eventi a livello cellulare che delle specifiche del destino cellulare nell’embrione è stata ottenuta utilizzando esperimenti di imaging uno alla volta relativamente ad alta risoluzione temporale (cioè acquisizioni ogni 10-100 s) di embrioni che esprimono fluorescenti. Anche se adatto per eventi in ordine da secondi a decine di minuti, questo approccio diventa tecnicamente limitante per la caratterizzazione di processi più lunghi, nell’ordine di ore a giorni. Lo sviluppo embrionale dalla prima scissione fino alla fine dell’allungamento richiede circa 10 h. A questo ritmo temporale, metodi semi-alti che consentirebbero l’imaging simultaneo a risoluzione temporale più bassa (cioè l’acquisizione a intervalli di tempo di 5-20 min) di coorti di embrioni più grandi, a diverse condizioni, avrebbero aperto una nuova serie di esperimenti; ad esempio, consentendo sforzi sistematici di screening su larga scala e l’analisi di un numero sufficiente di embrioni per confrontare le conseguenze delle perturbazioni molecolari.
Qui, descriviamo un metodo semi-alto per il monitoraggio dell’embriogenesi C. elegans che consente l’imaging time-lapse simultaneo dello sviluppo in 80-100 embrioni, da un massimo di 14 condizioni diverse, in un’unica esecuzione notturna. Il protocollo è semplice da implementare e può essere eseguito da qualsiasi laboratorio con accesso a un microscopio con capacità di point visiting. I passaggi principali di questo protocollo sono descritti nella Figura 1. In breve, gli embrioni vengono sezionati da adulti gravidi a predare che esprimono marcatori fluorescenti di interesse e trasferiscono embrioni giovani (stadio cellulare 2-8) a pozzi di una piastra di 384 pozze per l’imaging. In questo formato, le dimensioni relativamente piccole dei pozzi incanalano gli embrioni in un’area stretta, che facilita l’identificazione di campi contenenti più embrioni per l’imaging time-lapse. Per mantenere lo sviluppo approssimativamente sincrono attraverso la coorte di embrioni, le dissezioni vengono eseguite in supporti refrigerati e la piastra viene tenuta sul ghiaccio, il che impedisce uno sviluppo significativo durante la finestra temporale di dissezione della durata di un’ora. La piastra viene trasferita al microscopio e gli embrioni vengono filmati in una stanza a temperatura controllata durante la notte, a intervalli di tempo di 20 min, utilizzando una lente 60x di immersione dell’olio 1,35 NA, per raccogliere l’intera gamma z in 2 gradini. Cinquanta campi, ciascuno contenente tra 1 e 5 embrioni, sono immagine in un’unica pernottamento. A seconda dell’esperimento desiderato, la risoluzione del tempo potrebbe essere aumentata (ad esempio, l’imaging a intervalli da 5 a 10 min) diminuendo proporzionalmente il numero di campi immagine.
Con questo protocollo, anche una singola esecuzione notturna genera una notevole quantità di dati (80-100 embrioni distribuiti su 50 campi) e esperimenti più grandi possono diventare rapidamente ingestibili per quanto riguarda l’analisi dei dati. Per facilitare l’elaborazione, la visualizzazione e semplificare l’analisi di questi dati, è stato costruito un programma per ritagliare e orientare gli embrioni ed eseguire passaggi di pre-elaborazione (opzionale), e una macro ImageJ che compila i dati per semplificare la visualizzazione. Questi programmi possono essere utilizzati per elaborare immagini raccolte utilizzando approcci convenzionali, in quanto sono indipendenti dal metodo di imaging, che richiedono un solo piano di campo luminoso. Il primo programma prende in un campo 4D contenente più embrioni (opzione GUI o codice sorgente embryoCrop.py) o più campi 4D contenenti più embrioni (screenCrop.py), ben da muntire embrioni e li orienta in una configurazione anteriore-posteriore. Questi programmi offrono inoltre agli utenti la possibilità di eseguire la sottrazione in background, la correzione della deriva e la correzione dell’attenuazione. I file risultanti sono uniformemente pre-elaborati, impilati tiff strettamente tagliati per ogni embrione che sono modificabili per l’analisi automatica delle immagini. Per rendere più semplice visualizzare tutti gli embrioni per ogni condizione, è stata scritta una macro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm), che assembla tutti gli embrioni da una determinata condizione in un unico stack tiff e array immagini luminose e colore di proiezione massima intensità ( RGB) sovrapposizioni, affiancate, per ogni embrione. I metodi sono stati convalidati usandoli per caratterizzare lo sviluppo embrionale dopo aver abbattuto 40 geni di sviluppo descritti in precedenza in una coppia di ceppi fluorescenti personalizzati che esprimono marcatori fluorescenti ottimizzati per visualizzare gli aspetti chiave dello strato di germinale specifiche e morfogenesi10,11. Insieme, il protocollo di imaging embrionale semi-alto e gli strumenti di elaborazione delle immagini consentiranno esperimenti con numero di campioni più elevato e sforzi di screening su larga scala volti a comprendere i processi di sviluppo. Inoltre, questi ceppi forniranno anche un mezzo efficiente per esaminare gli effetti delle perturbazioni molecolari sull’embriogenesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro descrive una suite di strumenti e metodi che sono stati sviluppati per consentire sforzi su larga scala per profilare la funzione dei geni nello sviluppo embrionale in C. elegans. Il nostro metodo semi-alto-velocità consente l’imaging 3D time-lapse dello sviluppo embrionale a 20 minuti di risoluzione per 80-100 embrioni in un unico esperimento. Sebbene questo protocollo possa essere adattato per l’uso con qualsiasi ceppo o ceppo di marcatori desiderato, questo lavoro dimostra il potenziale del met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O. è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences-sponsorizzato University of California San Diego Institutional Research and Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. e K.O. sono stati sostenuti dal Ludwig Institute for Cancer Research, che ha anche fornito loro finanziamenti per la ricerca utilizzati per sostenere questo lavoro. Siamo grati a Andrew Chisholm per i suoi consigli nelle prime fasi di questo progetto, Ronald Biggs per i contributi a questo progetto dopo la fase iniziale di sviluppo del metodo, e Dave Jenkins e Andy Shiau per il supporto e l’accesso alla Small Molecule Discovery sistema di imaging ad alto contenuto del gruppo.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
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