C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット
Summary
本研究では、80~100 C.エレガンス胚の3Dタイムラプスイメージングを1回の夜間実行で可能にするセミハイスループットプロトコルについて説明します。さらに、データ分析を合理化するために、画像処理ツールと視覚化ツールが含まれています。カスタムレポーター株とこれらの方法の組み合わせは、胚発生の詳細なモニタリングを可能にします。
Abstract
C.エレガンスは、胚発生時の細胞運命仕様と形態形成過程の系統的解析のための最高のシステムです。1つの課題は、胚発生が約13時間にわたって動的に展開することです。この半日のタイムスケールは、画像化できる胚の数を制限することによって実験の範囲を制限している。ここでは、1回の夜間実行で、中程度の時間分解能で80~100個の胚の同時3Dタイムラプスイメージングを可能にするセミハイスループットプロトコルについて説明します。プロトコルは簡単で、ポイント訪問容量の顕微鏡へのアクセスを持つ任意の実験室によって実装することができる。このプロトコルの有用性は、生殖層の仕様および形態形成の主要な側面を視覚化するために最適化された蛍光マーカーを発現する2つのカスタム構築された株を画像化することによって実証される。データを分析するために、すべてのチャネル、Z ステップ、およびタイムポイントで、より広い視野から個々の胚をトリミングし、各胚のシーケンスを別々の tiff スタックに保存するカスタム プログラムが作成されました。ユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)を含むプログラムは、可視化または自動分析の準備のために個々の胚を分離、前処理、均一に指向することにより、データ処理を合理化します。また、個々の胚データをマルチパネルファイルにコンパイルし、各時点で各胚の最大強度蛍光投影と明視野画像を表示するImageJマクロも提供されています。本明細書に記載されているプロトコルおよびツールは、40の前に説明した発達遺伝子のノックダウン後に胚発生を特徴付けるためにそれらを使用することによって検証された;この分析は、以前にアノトされた発達表現型を可視化し、新しいものを明らかにした。要約すると、この研究では、クロッピングプログラムとImageJ可視化ツールを組み合わせた半ハイスループットイメージング法の詳細を説明し、有益な蛍光マーカーを発現する株と組み合わせることで、実験を大幅に加速して分析します。胚。
Introduction
C.エレガンス胚は、機械学的細胞生物学のための重要なモデルシステムであり、胚発生を駆動する細胞運命の仕様と形態形成過程の解析1、2、3、4 ,5,6,7,8,9.現在までに、胚における細胞レベルの事象と細胞運命仕様の両方の特徴付けの多くは、比較的高い時間分解能を1回に1回のイメージング実験(すなわち、10~100s毎に取得)を用いて達成されてきた。蛍光マーカー。数秒から数十分の順序でのイベントには適していますが、このアプローチは、時間単位から数日の順序で、より長いプロセスの特性評価を技術的に制限するようになります。最初の切断から伸びの終わりまでの胚の発達は約10時間かかります。この時間スケールでは、胚のより大きなコホートの同時に低い時間分解能イメージング(すなわち、5〜20分の時間間隔での取得)を可能にするセミハイスループット法は、異なる条件から、新しい範囲の実験を開くだろう。例えば、体系的な大規模スクリーニングの努力を可能にし、分子摂動の結果を比較するための十分な数の胚の分析を可能にする。
ここでは、C.エレガンス胚発生をモニタリングするセミハイスループット法について、最大14の異なる条件から、1回の夜間走行で、80~100個の胚における同時3Dタイムラプスイメージングを可能にする方法について説明する。プロトコルは実装が簡単で、ポイント訪問機能を備えた顕微鏡へのアクセスを持つ任意の実験室で行うことができます。このプロトコルの主な手順を図 1に示します。要するに、胚は、関心のある蛍光マーカーを発現する重症成人から解剖され、若い胚(2〜8細胞段階)をイメージング用の384ウェルプレートのウェルに移す。この形式では、比較的小さいウェルサイズのじょうごは、狭い領域に胚を漏斗し、タイムラプスイメージングのために複数の胚を含むフィールドの同定を容易にする。胚のコホート全体でほぼ同期的な発達を維持するために、解剖は冷蔵された媒体で行われ、プレートは氷の上に保持され、1時間の解剖時間枠の間に大きな発達を防ぐ。プレートを顕微鏡に移し、胚を一晩温度調節された部屋で撮影し、20分間隔で、60xオイル浸漬1.35 NAレンズを使用して、2μmステップで全Z範囲を収集する。1~5個の胚を含む50個のフィールドが、1回の夜間走行で画像化されます。目的の実験に応じて、画像化されたフィールドの数を比例的に減らすことで、時間分解能を増やすことができます(たとえば、5~10分間隔でのイメージング)。
このプロトコルを使用すると、1 回の夜間実行でも大量のデータ (50 フィールドに広がる 80 ~ 100 個の胚) が生成され、より大きな実験では、データ分析に関してすぐに管理不能になる可能性があります。このデータの処理、可視化、分析の合理化を容易にするために、胚をトリミングして指向し、前処理手順 (オプション) を実行するプログラムと、データをコンパイルして表示を簡略化する ImageJ マクロを作成しました。これらのプログラムは、イメージング方法に依存せず、単一の明視野面のみを必要とするため、従来のアプローチを使用して収集された画像を処理するために使用できます。最初のプログラムは、複数の胚(GUIオプションまたはソースコードembryoCrop.py)または複数の胚(screenCrop.py)を含む複数の4Dフィールドを含む4Dフィールドを取り込み、胚をしっかりとトリミングし、後部構成で向けます。これらのプログラムは、バックグラウンド減算、ドリフト補正、および減衰補正を実行するオプションもユーザーに提供します。結果として得られるファイルは、自動画像解析に修正可能な各胚に対して、均一に処理され、しっかりとトリミングされた tiff スタックです。各条件のすべての胚を簡単に表示できるように、ImageJ マクロ (OpenandCombine_embsV2.ijm) が書かれ、特定の条件からすべての胚を単一の tiff スタックにアセンブルし、明るいフィールドイメージと最大強度投影色 (RGB) オーバーレイは、各胚に対して並べて表示されます。この方法は、生殖層の主要な側面を可視化するために最適化された蛍光マーカーを発現する一対のカスタム構築された株で、40個の前に記述された発達遺伝子をノックダウンした後の胚発生を特徴付けるためにそれらを使用して検証された。仕様および形態形成10、11。セミハイスループット胚イメージングプロトコルと画像処理ツールを組み合わせることで、より高いサンプル数の実験と、開発プロセスの理解を目的とした大規模なスクリーニング作業が可能になります。さらに、これらの株はまた、胚発生に対する分子摂動の影響を調べるための効率的な手段を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、C.エレガンスにおける胚発生における遺伝子の機能をプロファイリングするために、より大規模な取り組みを可能にするために開発された一連のツールと方法について説明します。当社のセミハイスループット法により、1回の実験で80~100個の胚に対して20分分解能で胚発生の3Dタイムラプスイメージングが可能です。このプロトコルは任意の所望のマーカー株で使用する…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O.は、カリフォルニア州サンディエゴ大学サンディエゴ機関研究・学術キャリア開発賞(NIH/IRACDA K12 GM068524)の支援を受けています。A.D.とK.O.は、この研究を支援するために使用される研究資金を提供したルートヴィヒ癌研究所によって支援されました。私たちは、このプロジェクトの初期段階での彼のアドバイス、最初の方法開発段階の後にこのプロジェクトに貢献したロナルド・ビッグス、およびデイブ・ジェンキンスとアンディ・シーアウが小分子発見をサポートし、アクセスするために、彼のアドバイスに感謝していますグループのハイコンテンツイメージングシステム。
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
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