En semi-høy gjennomstrømming imaging metode og data visualisering Toolkit å analysere C. elegans embryonale utvikling
Summary
Dette arbeidet beskriver en protokoll for semi-høy gjennomstrømning som muliggjør samtidig 3D-embryogenesis i 80 – 100 C. elegans embryo i én nattkjøring. I tillegg er bildebehandlings-og visualiseringsverktøy inkludert for å effektivisere dataanalyse. Kombinasjonen av disse metodene med tilpassede reporter stammer muliggjør detaljert overvåking av embryogenesis.
Abstract
C. elegans er det fremste systemet for systematisk analyse av celle skjebne spesifikasjon og Morfogenetiske hendelser under embryonale utviklingen. En utfordring er at embryogenesis dynamisk utfolder seg over en periode på ca 13 h; Denne halv dag lange tidsskalaen har begrenset omfanget av eksperimenter ved å begrense antall embryo som kan bli avbildet. Her beskriver vi en semi-høy gjennomstrømming protokoll som gjør det mulig for samtidig 3D time-lapse Imaging av utviklingen i 80-100 embryo ved moderat tid oppløsning, fra opptil 14 forskjellige forhold, i en enkelt overnatting kjøre. Protokollen er grei og kan implementeres av ethvert laboratorium med tilgang til et mikroskop med punkt Besøks kapasitet. Nytten av denne protokollen er demonstrert ved å bruke den til bilde to spesialbygde stammer uttrykke fluorescerende markører optimalisert for å visualisere viktige aspekter av bakterie-lags spesifikasjon og morphogenesis. Å analysere dataene, et egendefinert program som beskjærer individuelle embryo ut av et bredere synsfelt i alle kanaler, z-trinn, og tidspunkter og lagrer sekvensene for hvert embryo i en egen TIFF-stabel ble bygget. Programmet, som inkluderer et brukervennlig grafisk brukergrensesnitt (GUI), effektiviserer databehandling ved å isolere, pre-prosessering, og jevnt orientere individuelle embryo i forberedelse til visualisering eller automatisert analyse. Også leveres er en ImageJ makro som kompilerer individuelle embryo data i en multi-panel fil som viser maksimal intensitet fluorescens projeksjon og brightfield bilder for hvert embryo på hvert tidspunkt. Protokollene og verktøyene som er beskrevet her, ble validert ved å bruke dem til å karakterisere embryonale utviklingen etter knock-Down av 40 tidligere beskrev utviklings gener; Denne analysen viste tidligere kommenterte utviklingsmessige fenotyper og avslørte nye. Oppsummert dette arbeidet detaljer en semi-høy gjennomstrømming imaging metode kombinert med et beskjæring program og ImageJ visualisering verktøy som, når kombinert med stammer uttrykker informative fluorescerende markører, akselererer sterkt eksperimenter for å analysere embryoutvikling.
Introduction
Den C. elegans embryo er en viktig modell system for mekanistisk cellebiologi og analyse av celle skjebne spesifikasjon og Morfogenetiske hendelser kjøring embryoutvikling1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Hittil er mye av karakterisering av både Cellular-Level Events og celle skjebne spesifikasjon i fosteret er oppnådd ved hjelp av relativt høy Temporal oppløsning en-til-en-time Imaging eksperimenter (dvs. oppkjøpet hver 10-100 s) av embryo uttrykke fluorescerende markører. Selv godt egnet for hendelser på rekkefølgen av sekunder til titalls minutter, denne tilnærmingen blir teknisk begrensende for karakterisering av lengre prosesser, på rekkefølgen av timer til dager. Embryonale utviklingen fra første kløft til slutten av forlengelse tar ca 10 h. På denne tidsskala, semi-høy gjennomstrømming metoder som ville tillate samtidig lavere tid oppløsning Imaging (dvs. oppkjøp på 5-20 min tidsintervaller) av større kohorter av embryo, fra ulike forhold, ville åpne opp en ny rekke eksperimenter; for eksempel, muliggjør systematisk storstilt screening innsats og analyse av tilstrekkelig antall embryo for sammenligninger av konsekvensene av molekylær forstyrrelser.
Her beskriver vi en semi-høy gjennomstrømming metode for overvåking C. elegans embryogenesis som muliggjør samtidig 3D time-lapse Imaging av utviklingen i 80-100 embryo, fra opp til 14 ulike forhold, i en enkelt overnatting kjøre. Protokollen er grei å implementere og kan utføres av ethvert laboratorium med tilgang til et mikroskop med punkt besøk evner. De viktigste trinnene i denne protokollen er skissert i figur 1. Kort sagt, embryo er dissekert fra gravid voksne uttrykker fluorescerende markører av interesse og overføre unge embryo (2-8 celle scenen) til brønner av en 384-brønn plate for Imaging. I dette formatet, den relativt liten brønn størrelse trakter embryo inn i et smalt område, noe som forenkler identifisering av felt som inneholder flere embryo for time-lapse Imaging. For å opprettholde omtrent synkron utvikling på tvers av kohort av embryo, er dissections utført i kjølt Media og platen holdes på isen, noe som hindrer betydelig utvikling i løpet av time lange disseksjon tid vinduet. Platen er overført til mikroskopet og embryo er filmet i en temperatur-kontrollerte rom over natten, ved 20 min tidsintervaller, ved hjelp av en 60x olje nedsenking 1,35 NA linse, for å samle hele z-serien i 2 μm trinn. 50 felt, som hver inneholder mellom 1 til 5 embryo, er avbildet i en enkelt overnatting kjøre. Avhengig av det ønskede eksperimentet kan tids oppløsningen økes (for eksempel ved 5 – 10 minutters intervaller) ved å redusere antallet bildefelter proporsjonalt.
Med denne protokollen, selv en eneste natten kjører genererer en betydelig mengde data (80-100 embryo spredt ut over 50 felt) og større eksperimenter kan raskt bli uhåndterlig med hensyn til dataanalyse. For å lette behandlingen, visualisering og effektivisere analysen av disse dataene, ble et program bygget for å beskjære ut og orientere embryo og utføre pre-prosessering trinn (valgfritt), og en ImageJ makro som kompilerer dataene for å forenkle visning. Disse programmene kan brukes til å behandle bilder som er samlet inn ved hjelp av konvensjonelle tilnærminger, som de er uavhengige av tenkelig metode, som krever bare en enkelt brightfield fly. Det første programmet tar i en 4D-feltet som inneholder flere embryo (GUI alternativ eller kildekoden embryoCrop.py) eller flere 4D felt som inneholder flere embryo (screenCrop.py), tett avlinger embryo og orienterer dem i en fremre-bakre konfigurasjon. Disse programmene også gi brukerne muligheten til å utføre bakgrunns subtraksjon, drift korreksjon, og demping korreksjon. Den resulterende filene er jevnt pre-behandlet, tett beskjæres TIFF stabler for hvert embryo som er amendable til automatisert bildeanalyse. For å gjøre det enklere å se alle embryo for hver betingelse, en ImageJ makro (OpenandCombine_embsV2. ijm) ble skrevet, som samler alle embryo fra en gitt tilstand i en enkelt TIFF stack og arrays brightfield bilder og maksimal intensitet projeksjon farge ( RGB)-overlegg, side ved side, for hvert embryo. Metodene ble validert ved å bruke dem til å karakterisere embryoutvikling etter knock-Down av 40 tidligere beskrevet utviklingsmessige gener i et par spesialbygde stammer uttrykke fluorescerende markører optimalisert for å visualisere viktige aspekter av bakterie-lag spesifikasjonog morphogenesis. Sammen vil den semi-høy gjennomstrømming embryo Imaging Protocol og bildebehandling verktøy muliggjør høyere sample antall eksperimenter og stor skala screening innsats som tar sikte på å forstå utviklingsmessige prosesser. I tillegg vil disse stammene også gi et effektivt middel for å undersøke virkningene av molekylær forstyrrelser på embryogenesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbeidet beskriver en pakke med verktøy og metoder som ble utviklet for å muliggjøre større skala innsats for å Profile funksjonen av gener i embryoutvikling i C. elegans. Vår semi-høy gjennomstrømming metoden tillater 3D time-lapse Imaging av embryoutvikling på 20 min oppløsning for 80-100 embryo i et enkelt eksperiment. Selv om denne protokollen kan tilpasses for bruk med ønsket markør stamme (r), demonstrerer dette arbeidet potensialet i metoden ved hjelp av to tilpassede stammer utviklet fo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O. ble støttet av National Institute of General Medical Sciences-sponset University of California San Diego institusjonelle forsknings-og akademiske karriere Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. og K.O. ble støttet av Ludwig Institute for Cancer Research, som også ga dem med forskningsmidler brukes til å støtte dette arbeidet. Vi er takknemlige for Andrew Chisholm for hans råd i de tidlige fasene av dette prosjektet, Ronald Biggs for bidrag til dette prosjektet etter den første metoden utviklingsfasen, og Dave Jenkins og Andy Shiau for støtte og tilgang til Small molekyl Discovery gruppens høy-innhold tenkelig system.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
- Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
- Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
- Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
- Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
- Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
- Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Dryad Digital Repository. , (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Zenodo. , (2018).
- . Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. 발생학. 100 (1), 64-119 (1983).
- Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
- Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
- Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
- Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).
