रोगी-व्युत्पन्न अग्नाशय डक्टल एडेनोकार्सिनोमा ऑर्गेनॉइड मॉडल का अलगाव और लक्षण वर्णन
Summary
अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा की रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड संस्कृतियां एक तेजी से स्थापित 3-आयामी मॉडल हैं जो उच्च निष्ठा के साथ एपिथेलियल ट्यूमर सेल डिब्बों का प्रतिनिधित्व करती हैं, जिससे इस घातक द्रोह में अनुवादात्मक अनुसंधान सक्षम होता है। यहां, हम इन मॉडलों का उपयोग करके प्रासंगिक जैविक परखों को स्थापित करने और प्रचारित करने के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं।
Abstract
अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) सबसे घातक घातक घातक में से एक है। हाल ही में, इस बीमारी के 3-आयामी (3 डी) मॉडलिंग को सक्षम करने वाली अगली पीढ़ी के ऑर्गेनॉइड संस्कृति विधियों का वर्णन किया गया है। रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (PDO) मॉडल को शल्य चिकित्सा नमूनों के साथ-साथ छोटी बायोप्सी और संस्कृति में तेजी से रूप से अलग किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, ऑर्गेनॉइड मॉडल रोगी के ट्यूमर में पाए गए रोगजनक आनुवंशिक परिवर्तनों को संरक्षित करते हैं और रोगी के उपचार की प्रतिक्रिया के भविष्य कहनेवाला होते हैं, इस प्रकार अनुवादात्मक अध्ययन को सक्षम करते हैं। यहां, हम 3डी, मैट्रिक्स एम्बेडेड, ऑर्गेनॉइड मॉडल का अध्ययन करने के लिए ऊतक संस्कृति कार्यप्रवाह को अनुकूलित करने के लिए व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम प्राथमिक पीडीएसी ऑर्गेनॉइड को अलग-थलग करने और प्रचारित करने के तरीकों और विचारों का विस्तार करते हैं। इसके अलावा, हम वर्णन करते हैं कि प्रयोगशाला में बीस्पोक ऑर्गेनॉइड मीडिया कैसे तैयार किया जाता है और गुणवत्ता नियंत्रित होती है। अंत में, हम ऑर्गेनॉइड मॉडलजैसे न्यूक्लिक एसिड (डीएनए और आरएनए) के अलगाव और दवा परीक्षण के डाउनस्ट्रीम लक्षण वर्णन के लिए परखों का वर्णन करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि हम एक अनुसंधान प्रयोगशाला में ऑर्गनॉइड पद्धति को लागू करने के लिए महत्वपूर्ण विचार प्रदान करते हैं ।
Introduction
अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) एक घातक बीमारी है जो ज्यादातर रोगियों में देर से निदान, प्रभावी उपचारों की कमी और परिणामी कम 5 साल की समग्र जीवित रहने की दर है जो 10% से कम1बनी हुई है। केवल 20% रोगियों को उपचारात्मक शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप2,3के लिए उपयुक्त स्थानीयकृत रोग का निदान किया जाता है । शेष रोगियों का आमतौर पर कीमोथेरेपी एजेंटों के संयोजन से इलाज किया जाता है जो4,5रोगियों के अल्पसंख्यक में प्रभावी होते हैं । इन दबाने वाली नैदानिक जरूरतों को पूरा करने के लिए, शोधकर्ता सक्रिय रूप से जल्दी पता लगाने की रणनीतियों और अधिक प्रभावी उपचारों के विकास पर काम कर रहे हैं । महत्वपूर्ण खोजों के नैदानिक अनुवाद में तेजी लाने के लिए, वैज्ञानिक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल, रोगी व्युत्पन्न विद्वेष, मोनोलेयर कोशिकाओं लाइनों, और सबसे हाल ही में, ऑर्गेनॉइड मॉडल6को नियोजित कर रहे हैं ।
अबदलजनक जनक कोशिकाओं के प्रसार को प्रोत्साहित करने के लिए विकास कारक और Wnt-ligand समृद्ध परिस्थितियों का उपयोग करतीन आयामी एपिथेलियल ऑर्गेनोइड संस्कृति को पहले माउस आंत7 के लिए वर्णित किया गया था और जल्दी से सामान्य मानव अग्नाशय केऊतक8के अनुकूल थे। सामान्य डक्टल ऊतक के अलावा, ऑर्गेनॉइड पद्धति मानव पीडीएसी8के अलगाव, विस्तार और अध्ययन के लिए अनुमति देती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि विधि शल्य नमूनों से ऑर्गेनॉइड की स्थापना के साथ-साथ ठीक और कोर सुई बायोप्सी का समर्थन करती है, जिससे शोधकर्ताओं को9,10रोग के सभी चरणों का अध्ययन करने की अनुमति मिल जाती है। दिलचस्प बात यह है कि रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड अच्छी तरह से वर्णित ट्यूमर ट्रांसक्रिप्टोमिक उपप्रकारों को फिर से तैयार करते हैं और सटीक दवा प्लेटफार्मों9,11के विकास को सक्षम कर सकते हैं।
पीडीएसी के लिए वर्तमान ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल कीमो-भोली रोगियों से 70% से अधिक रोगी नमूनों के सफल विस्तार को सक्षम करते हैं9. यहां हम रोगी-व्युत्पन्न पीडीएसी ऑर्गेनॉइड को अलग करने, विस्तारित करने और चित्रित करने के लिए हमारी प्रयोगशाला द्वारा नियोजित मानक विधियों को प्रस्तुत करते हैं। अन्य पीडीएसी ऑर्गेनोइड पद्धतियों को12,13 वर्णित किया गया है लेकिन इन विधि की कोई तुलना पूरी तरह से नहीं की गई है। चूंकि यह तकनीक अपेक्षाकृत नई है और जल्दी से आगे बढ़ रही है, इसलिए हम उम्मीद करते हैं कि ये प्रोटोकॉल विकसित और सुधार जारी रखेंगे; हालांकि ऊतक हैंडलिंग और ऑर्गेनोइड संस्कृति के सिद्धांत उपयोगी बने रहेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम रोगी-व्युत्पन्न पीडीएसी ऑर्गेनॉइड को अलग करने, विस्तार करने और चित्रित करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ऑर्गेनोइड संस्कृति की स्थापना की हमारी वर्तमान सफलता दर 70% से अधिक है; इ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम यूसी सैन डिएगो मूर्स कैंसर सेंटर बायोरेपोसिटररी और टिश्यू टेक्नोलॉजी साझा संसाधन, लोवी प्रयोगशाला के सदस्यों और यूसी सैन डिएगो सर्जरी विभाग, सर्जिकल ऑन्कोलॉजी के प्रभाग के समर्थन के लिए आभारी हैं। एएमएल उदारता से NIH CA155620, एक SU2C CRUK Lustgarten फाउंडेशन अग्नाशय के कैंसर ड्रीम टीम पुरस्कार (SU2C-AACR-DT-20-16), और निधि के लिए दानदाताओं अग्नाशय के कैंसर का इलाज द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
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