Isolering och karakterisering av patient-derived bukspottskörteln ductal adenocarcinom Organoid modeller

Summary

Patient-härledda Organoid kulturer av bukspottskörteln duktal adenocarcinom är en snabbt etablerad 3-dimensionell modell som representerar epitelial tumör cell fack med hög trohet, möjliggör translationell forskning i denna dödliga malignitet. Här ger vi detaljerade metoder för att etablera och propagera organoider samt för att utföra relevanta biologiska analyser med hjälp av dessa modeller.

Abstract

Bukspottskörteln duktal adenocarcinom (PDAC) är bland de mest dödliga maligniteter. Nyligen, nästa generations Organoid kultur metoder som möjliggör 3-dimensionell (3D) modellering av denna sjukdom har beskrivits. Patient-härledda Organoid (sub) modeller kan isoleras från både kirurgiska prover samt små biopsier och bilda snabbt i kulturen. Viktigare, Organoid modeller bevara patogena genetiska förändringar upptäcks i patientens tumör och är prediktiva för patientens behandlingssvar, vilket möjliggör translationella studier. Här tillhandahåller vi omfattande protokoll för att anpassa arbetsflödet för vävnadskulturer för att studera 3D, Matrix Embedded, Organoid-modeller. Vi specificerar metoder och överväganden för att isolera och sprida primära PDAC-organoider. Dessutom beskriver vi hur skräddarsydda Organoid media är förberedd och kvalitetskontrollerad i laboratoriet. Slutligen beskriver vi analyser för nedströms karakterisering av Organoid modeller såsom isolering av nukleinsyror (DNA och RNA), och drogtester. Viktigt att vi ger kritiska överväganden för att implementera Organoid metodik i ett forskningslaboratorium.

Introduction

Pankreas duktal adenocarcinom (PDAC) är en dödlig sjukdom som kännetecknas av sen diagnos hos de flesta patienter, en brist på effektiva terapier, och en resulterande låg 5-års total överlevnad som förblir mindre än 10%¹. Endast 20% av patienterna diagnostiseras med en lokaliserad sjukdom som lämpar sig för botande kirurgiska ingrepp^2,3. De kvarvarande patienterna behandlas vanligen med en kombination av kemoterapeutiska medel som är effektiva hos en minoritet av patienterna^4,5. För att hantera dessa akuta kliniska behov arbetar forskarna aktivt med tidiga detektions strategier och utveckling av effektivare terapier. För att påskynda klinisk översättning av viktiga upptäckter, forskare anställer genetiskt modifierade musmodeller, patient härrör xenografts, enskiktslager celler linjer, och, senast, Organoid modeller⁶.

Tredimensionell epitelial Organoid kultur med hjälp av tillväxtfaktor och WNT-ligand rika förhållanden för att stimulera spridningen av otransformerade progenitorceller beskrevs först för mus tarmen⁷ och var snabbt anpassas till normala mänskliga bukspottskörteln vävnad⁸. Förutom normal duktal vävnad, Organoid metodik möjliggör isolering, expansion, och studier av mänskliga PDAC⁸. Viktigt, metoden stöder inrättandet av organoider från kirurgiska prover, samt böter och kärna nål biopsier, så att forskarna att studera alla stadier av sjukdomen^9,10. Intressant, patient-härledda organoider recapitulate väl beskrivna tumör transcriptomic subtyper och kan möjliggöra utveckling av precisionsmedicin plattformar^9,11.

Aktuella Organoid-protokoll för PDAC möjliggör en lyckad expansion av mer än 70% av patientproverna från kemonaiva patienter⁹. Här presenterar vi de standardmetoder som används av vårt laboratorium för att isolera, expandera och karakterisera patient härledda PDAC-organoider. Andra PDAC Organoid metoder har beskrivits^12,13 men ingen jämförelse av denna metod har utförts grundligt. Eftersom denna teknik är relativt ny och framåt snabbt, förväntar vi oss att dessa protokoll kommer att fortsätta att utvecklas och förbättras; men principerna för vävnads hantering och Organoid kultur kommer att fortsätta att vara användbar.

Protocol

All insamling av mänskliga vävnader för forskningsbruk granskades och godkändes av vår interna granskningsnämnd (IRB). Alla följande protokoll utförs under aseptiska förhållanden i ett laboratorium miljö för däggdjur vävnad kultur. 1. förberedelse av media Konditionerade medier förberedelse.Obs: den mänskliga bukspottskörteln Organoid Media kräver riklig tillväxtfaktorer och näringsämnen samt konditionerade Media tillskott för att ge tillräcklig tillväxts…

Representative Results

För att illustrera de utmaningar som är förknippade med att isolera organoider från PDAC, visar vi inrättandet av en patient som härrör Organoid kultur från en liten hypocellulära tumör prov. Efter inledande plätering, endast ett fåtal organoider var synliga per brunn, som visas i figur 1. Organoider tilläts växa större under loppet av 2 vecka och var blint enligt vårt protokoll för att etablera en mer robust kultur, som visas i början och slutet av passage 1 representativa…

Discussion

Här presenterar vi aktuella protokoll för att isolera, utvidga och karakterisera patient härledda PDAC-organoider. Vår nuvarande framgång för att etablera Organoid kultur är över 70%; Därför har dessa metoder ännu inte fulländat och förväntas förbättra och utvecklas med tiden. Viktigt övervägande bör ges till provstorlek, som PDAC har en låg neoplastisk cellularitet. Följaktligen, små prover kommer att innehålla några tumörceller, och kommer bara att generera en handfull organoider. Dessutom, må…

Materials

12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips
12 well plates	Olympus	25-106
15 ml LoBind conical tubes	Eppendorf	EP0030122208
15 ml tube Rotator and/or nutator
37 °C CO2 incubator
37 °C water bath
384 well plates	Corning	4588	Ultra low attachment, black and optically clear
A 83-01	TOCRIS	2939
ADV DMEM	ThermoFisher	12634010
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Automated cell counter
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
Cell Recovery Solution	Corning	354253	Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C
CellTiterGlow	Promega	G7570	Luminescence cell viability reagent
Chloroform	Sigma	C2432
Computer
CryoStor CS10	StemCELL Tech	07930	Cell Freezing Solution
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells	Trevigen	3710-001-K
DMEM	ATCC	30-2002
DNase I	Sigma	D5025
Drug printer	Tecan	D300e	This is the drug printer we use in our laboratory
Excel			For data analysis
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11150-10
FBS	ThermoFisher	16000044
G-418	ThermoFisher	10131035
Gastrin I (human)	TOCRIS	3006
Gentle Collagenase/hyaluronidase	STEMCELL Tech	7919
GlutaMAX	ThermoFisher	35050061	Glutamine solution
GraphPad Prism			For data analysis
HEPES	ThermoFisher	15140122
Laminar flow tissue culture hood
Luminometer
L-Wnt-3A expressing cells	ATCC	CRL-2647
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi biotec	130-100-008
Matrigel Matrix	Corning	356230	Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced
Mr. Frosty Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636
p1000 pipette with tips
p200 pipette with tips
PBS	ThermoFisher	10010049
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher	15630080
primocin	InvivoGen	ant-pm-2
Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm)	ThermoFisher	121-0020
Recombinant Human FGF-10	Peprotech	100-26
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade	VWR	89176-380
Tissue culture centrifuge
Tissue Culture Dishes 10 cm	Olympus	25-202
TRIZol	ThermoFisher	15596018	Acid Phenol solution
TrypLE Express	ThermoFisher	12605010
Y-27632	Sigma	Y0503
Zeocin	ThermoFisher	R25001