Etichettatura e imaging di placche amiloidi nel tessuto cerebrale utilizzando la curcumina polifenolo naturale
Summary
La curcumina è un fluoroforo ideale per l’etichettatura e l’imaging di placche proteiche beta amiloidi nel tessuto cerebrale a causa del suo legame preferenziale alla proteina beta amiloide e delle sue somiglianze strutturali con altri coloranti di legame amiloidi tradizionali. Può essere utilizzato per etichettare e immagini placche proteiche beta amiloidi in modo più efficiente ed economico rispetto ai metodi tradizionali.
Abstract
La deposizione di proteine beta amiloidi (A) in spazi extra e intracellulari è una delle patologie distintive del morbo di Alzheimer (AD). Pertanto, il rilevamento della presenza di A , nel tessuto cerebrale dell’AD, è uno strumento prezioso per lo sviluppo di nuovi trattamenti per prevenire la progressione dell’AD. Diversi coloranti di legame amiloide classici, fluorocro, sonde di imaging e anticorpi specifici per l’AO sono stati utilizzati per rilevare l’A – istochimicamente nel tessuto cerebrale dell’AD. L’uso di questi composti per il rilevamento di A – è costoso e richiede molto tempo. Tuttavia, a causa della sua intensa attività fluorescente, dell’alta affinità e della specificità per l’Az, così come le somiglianze strutturali con i coloranti leganti amiloidi tradizionali, la curcumina (Cur) è un promettente candidato per l’etichettatura e l’imaging delle placche A tessuto cerebrale. È un polifenolo naturale dell’erba Curcuma longa. Nel presente studio, Cur è stato utilizzato per etichettare istochimicamente placche di Az sia da un modello murino genetico della malattia di Alzheimer familiare 5x (5xFAD) e dal tessuto umano AD entro un minuto. La capacità di etichettatura di Cur è stata confrontata con i tradizionali coloranti di legame amiloide, come thioflavin-S (Thio-S), Congo rosso (CR) e Fluoro-jade C (FJC), così come gli anticorpi specifici di Az (6E10 e A11). Abbiamo osservato che Cur è il modo più economico e più veloce per etichettare e immagini le placche DiZ rispetto a questi coloranti convenzionali ed è paragonabile agli anticorpi specifici di A . Inoltre, Cur si lega con la maggior parte delle specie di A, come oligomeri e fibrille. Pertanto, Cur potrebbe essere utilizzato come l’agente di rilevamento fluorocro più conveniente, semplice e veloce per le placche A .
Introduction
Il morbo di Alzheimer (AD) è uno dei disturbi neurologici più comuni, legati all’età e progressivi e una delle principali cause di morte in tutto il mondo1,2. Apprendimento, memoria, e compromissione della cognizione, insieme a disturbi neuropsichiatrici, sono i sintomi comuni manifestati in AD3. Anche se l’eziologia dell’AD non è stata completamente chiarita, le prove genetiche, biochimiche e sperimentali disponibili indicano che la graduale deposizione di Ao è un biomarcatore definitivo per AD4. Questa proteina piegata male si accumula negli spazi intracellulari ed extracellulari ed è pensata per essere coinvolta nella perdita sinaptica, nell’aumento della neuroinfiammazione e nella neurodegenerazione nelle regioni corticali ed ippocampali nel cervello colpite daAD 5. Pertanto, il rilevamento istochimico di A , nel tessuto AD, è un primo passo fondamentale nello sviluppo di farmaci anti-amiloidi non tossici per prevenire la progressione dell’AD.
Nel corso degli ultimi decenni, diversi coloranti e anticorpi sono stati utilizzati da molti laboratori di ricerca per etichettare e immagini le placche A – nel tessuto cerebrale, ma alcuni di questi metodi richiedono molto tempo e i coloranti o gli anticorpi utilizzati sono costosi, richiedendo diversi accessori Prodotti chimici. Pertanto, lo sviluppo di un mezzo economico di rilevamento delle placche di AC nel cervello AD sarebbe un nuovo strumento gradito. Molti laboratori hanno iniziato a utilizzare Cur, un promettente polifenolo naturale anti-amiloide, per l’etichettatura e l’imaging di A, nonché un agente terapeutico per AD6,7,8,9. La sua idropobicità e la natura lofilica, le somiglianze strutturali con i coloranti leganti amiloidi classici, la forte attività fluorescente, così come la forte affinità da legare con l’Az lo rendono un fluoroforo ideale per l’etichettatura e l’imaging delle placche di A . Cur si lega con le placche az e oligomeri e la sua presenza viene rilevata anche negli spazi intracellulari7,11,12,13. Inoltre, è stato dimostrato che una quantità minima di Cur può etichettare le placche affar-Alzheimer familiari 5x (5xFAD)7. Anche se la concentrazione di 1 nM non fornisce l’intensità di fluorescenza ottimale per il conteggio delle placche di Ao, una concentrazione di 10 nM o superiore di Cur fa. Ran e colleghi14 hanno riferito che dosi a partire da 0,2 nM di Cur derivato da difluoroboron sono in grado di rilevare i depositi in vivo di A, quasi come una sonda a infrarossi. Non è ancora chiaro se questa dose sia sufficiente per etichettare le placche di Az nei tessuti. La maggior parte degli studi precedenti ha utilizzato 20-30 min per colorare le placche di Az usando Cur, ma la colorazione ottimale può richiedere molto meno tempo.
Il presente studio è stato progettato per testare il tempo minimo richiesto da Cur per etichettare le placche di Az nel tessuto cerebrale dell’AD e per confrontare la sensibilità per l’etichettatura e l’imaging delle placche di A, dai topi 5xFAD dopo la colorazione con Cur con altri Coloranti leganti a z, come Thioflavin-S (Thio-S), Congo rosso (CR) e Fluoro-jade C (FJC). La capacità di etichettatura di questi classici coloranti di legame amiloide è stata confrontata con la colorazione in sezioni cerebrali coronariche incorporate in paraffina e criostati da topi 5xFAD e da tessuto umano e di controllo del cervello. I risultati suggeriscono che Cur etichetta le placche di Az in modo simile agli anticorpi specifici di A – (6E10) e moderatamente migliore di Thio-S, CR o FJC. Inoltre, quando sono state somministrate iniezioni intraperiteali di topi Cur to 5xFAD per 2/5 giorni, ha attraversato la barriera emato-encefalica e legato con placche ad Ao7. È interessante notare che, le concentrazioni nanomolare di Cur sono state utilizzate per etichettare e l’immagine placche di Ao nel tessuto cerebrale 5xFAD7,14. Inoltre, le placche di A, come le placche di nucleo, neuritiche, diffuse e bruciate, possono essere etichettate da Cur in modo più efficiente rispetto a qualsiasi altro colorante di legame amiloide convenzionale7. Nel complesso, Cur può essere applicato per etichettare e immagini placche az in tessuto cerebrale post-mortem da modelli animali AD e/o tessuto AD umano in modo semplice ed economico, come alternativa affidabile agli anticorpi specifici di A.
Protocol
Representative Results
Discussion
La nostra ipotesi era che Cur potesse essere usato come il modo più veloce, semplice e meno costoso per etichettare e immaginile le placche A e az nel tessuto cerebrale dell’AD postmortem rispetto ad altri coloranti di legame amiloide classici, così come gli anticorpi specifici di Az. Gli obiettivi di questo studio erano determinare il tempo minimo necessario per etichettare e immagini le placche di Az da Cur nel tessuto cerebrale post mortem AD e determinare se Cur può essere utilizzato come alternativa agli anticorp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il sostegno a questo studio è venuto dal Field Neurosciences Institute di Ascension of St. Mary’s.
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1×70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
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