Chip-basert super-oppløsning optiske mikroskopi er en ny tilnærming til fluorescens mikroskopi og gir fordeler i kostnadseffektivitet og gjennomstrømning. Her vises protokollene for klargjøring av chip og bildebehandling for TIRF-mikroskopi og lokaliserings BAS ert super oppløsnings mikroskopi.
Total intern refleksjon fluorescens (TIRF) er vanligvis brukes i enkelt molekyl lokalisering basert super-oppløsning mikroskopi som det gir forbedret kontrast på grunn av optisk snitting. Den konvensjonelle tilnærmingen er å bruke høy numerisk blenderåpning mikroskop TIRF mål for både eksitasjon og samling, sterkt begrenser synsfelt og gjennomstrømning. Vi presenterer en ny tilnærming til å generere TIRF eksitasjon for Imaging med optiske bølgeledere, kalt chip-baserte nanoscopy. Målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan chip-basert Imaging er utført i en allerede bygget oppsett. Den største fordelen med chip-basert nanoscopy er at eksitasjon og samlingen trasé er koblet. Imaging kan deretter gjøres med en lav forstørrelse linse, noe som resulterer i store synsfelt TIRF bilder, til prisen av en liten reduksjon i oppløsning. Liver sinusformet endothelial celler (LSECs) ble avbildet ved hjelp av direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (dstorm), viser en oppløsning som kan sammenlignes med tradisjonelle super-oppløsning mikroskop. I tillegg viser vi høy gjennomstrømming evnene ved Imaging en 500 μm x 500 μm regionen med en lav forstørrelse linse, som gir en oppløsning på 76 NM. Igjennom dens kompakt blokkannulleringstegn, flis-basert tenkelig kan ettermonteres i høyst vanlig mikroskop og kan kombinert med annet opp på-flis optisk teknikker, som opp på-flis sensing, spektroskopi, optisk overlappe, etc. Teknikken er således ideell for høy gjennomstrømming 2D super-oppløsning Imaging, men tilbyr også store muligheter for multi-modal analyse.
Siden den første demonstrasjonen av enkelt molekyl lokalisering mikroskopi, har mange variasjoner blitt utviklet for å løse ulike utfordringer1,2,3. En utfordring som har vært, men er stort synsfelt dSTORM Imaging. Mange dstorm oppsett bruke samme objektiv linse til både opphisse prøven og til bildet det. For å øke synsfeltet, er en lav forstørrelse linse nødvendig. Lav forstørrelse og lav numerisk blenderåpning (NA) objektiv linser vanligvis har en stor dybdeskarphet, noe som resulterer i en økt ut-av-fly signal som vil redusere lokalisering presisjon. TIRF mål brukes vanligvis til å øke bildekontrasten ved å redusere ut-av-plan-fluorescens. Gjennom TIRF er eksitasjon begrenset til en optisk tykkelse på ca. 150 NM fra overflaten ved hjelp av et evanescent felt4. TIRF objektiv linser krever en stor NA som resulterer i et lite felt-of-view (FOV) (f. eks, 50 x 50 μm2), som begrenser gjennomstrømningen betraktelig. Det finnes imidlertid alternative måter å generere et evanescent felt på.
En optisk waveguide er en struktur som vil begrense og veilede lys hvis det er koblet inn i strukturen. Vanligvis brukes bølgeledere i fiberbasert telekommunikasjon. Det er gjort stor innsats for å utvikle 2D-integrerte bølgeledere som en hovedkomponent i fotoniske integrerte kretser. Teknologien har avansert til et punkt der fabrikere lavt tap nano-strukturert optiske bølgeledere kan rutinemessig gjøres5. I dag kan flere støperier rundt om i verden brukes til å utvikle fotoniske integrerte kretser. Bølgeledere guide lys gjennom totale interne refleksjon også viser et evanescent felt på overflaten. Ved forsiktig utforming av waveguide strukturen, kan en høy intensitet oppnås i evanescent feltet. En prøve plassert direkte på toppen av den waveguide overflaten kan dermed også bli opplyst av evanescent-feltet for bildebehandlingsprogrammer. Det evanescent feltet vil bli generert langs hele lengden og bredden av waveguide, og dermed kan det gjøres vilkårlig stor6.
Vi presenterer en ny tilnærming til TIRF dstorm som tilbyr et vilkårlig stort synsfelt. I stedet for å bruke en TIRF linse for både eksitasjon og samling, vi opphisse bruker evanescent feltet fra optiske bølgeledere. Dette decouples eksitasjon og oppsamlings lys vei, noe som åpner for total frihet langs oppsamlings lys banen uten at det går ut over den optiske snitting for en gitt bølgelengde gitt av waveguide chip-belysning. Lav forstørrelse linser kan dermed brukes til bildet svært store regioner i TIRF modus, selv om en mindre NA vil redusere lateral oppløsning. Videre er flerfarget Imaging også sterkt forenklet med bølgeledere7, som flere bølgelengder kan styres og oppdages uten justere systemet. Dette er fordelaktig for dstorm, så lave bølgelengder kan brukes til å forbedre fluoroforen blinke og for flerfarget Imaging. Det er verdt å merke seg at gjennomtrengning dybden av evanescent feltet vil endres som en funksjon av bølgelengde, selv om det ikke påvirker hvordan tenkelig prosedyren er utført. Brikken er kompatibel med live celle Imaging8 og er ideell for applikasjoner som integrering av materialer. Hver chip kan inneholde titalls bølgeledere, som kan tillate brukeren å bilde under ulike forhold eller bruke optisk overlapping9 og Raman spektroskopi10.
Det chip-baserte systemet fungerer like godt for både Diffraksjon og super oppløselig bildebehandling. En lignende tilnærming ble innført i 2005 ved hjelp av et prisme for å generere evanescent feltet eksitasjon4. Den fotoniske chip interesserer også gjennom evanescent feltet, men med moderne waveguide fabrikasjon teknikker, kan man generere eksotiske lys mønstre med bølgeledere. Den nåværende chip-baserte nanoscopy gjennomføringen er begrenset til 2D Imaging bare, som eksitasjon feltet er låst inne i waveguide overflaten. Fremtidig utvikling vil sikte for 3D-applikasjoner. I tillegg utvikles andre super oppløsnings teknikker som strukturert belysnings mikroskopi ved hjelp av samme chip-baserte mikroskop11.
Chip-basert Imaging ligner konvensjonelle dstorm Imaging. Bildekvaliteten kan dermed gauged ved hjelp av de samme tilnærmingene som for tradisjonelle dstorm Imaging. Den største forskjellen for brukeren er at den gjennomsiktige glass lysbilde utveksles med en ugjennomsiktig si-wafer. Selv om de vises svært forskjellige, er prøven håndtering praktisk talt analoge til et glass lysbilde. Flisen er ganske solid og kan enkelt håndteres ved hjelp av wafer pinsett. Den Imaging prosedyre og bilde rekonstruksjon er den samme som i en vanlig dstorm eksperiment. Å sette opp et funksjonelt chip-basert mikroskop krever ingen spesielle komponenter, bortsett fra de fotoniske sjetongene. Ytterligere detaljer om oppsettet finnes i tidligere arbeid6,7. Sjetongene som brukes i dette arbeidet har blitt fabrikkert ved hjelp av standard Foto litografi8.
Prøve preparatet omfatter tilberedning av prøvekammeret. Når du fester PDMS-rammen til brikken, er det avgjørende å unngå små folder eller riper der luft kan komme inn. Hvis PDMS folder når du fester den, bare ta den forsiktig med en TWEEZER og fest den. Når prøven er klar inne i PDMS kammeret, må dekkglass trykkes mot den, tetting regionen. Det er viktig å unngå eventuelle luftbobler som kan dannes når du fester dekkglass. Hvis en luftboble dannes, Fjern forsiktig dekkglass og Legg PBS til prøvekammeret for å sikre at prøven er dekket. Utarbeidelse og festing av dekselet slip kan deretter bare gjøres om.
Koplings lys inn i waveguide er forenklet ved hjelp av protokollen foreslått i dette papiret. Det er imidlertid noen vanlige utfordringer som kan begrense koplingen. For det første, hvis brikken ikke ble rengjort riktig og eventuelle leftover PBS fjernet helt, kan det være skitt eller krystallisert PBS på waveguide. Dette kan innføre store tap, noe som resulterer i svært lite strøm i Imaging regionen. Ved hjelp av en fuktig serviett å rengjøre regionen utenfor dekselet glass kan forbedre kraften betraktelig. For det andre, hvis koblings egenskapen til waveguide er skadet (f.eks. ved uriktig håndtering), kan koplings tapet øke drastisk. Optisk inspeksjon av kanten vil vanligvis avdekke eventuelle skader lett. Hele koplingen fasett av brikken kan være polert nøye, mye som en optisk fiber, og vil gi en jevn kopling fasett, som deretter øker kombinert strøm.
Etter at lyset er koplet, er bildebehandlingen den samme som i enhver konvensjonell dstorm setup. Hvis bildet har inhomogen eksitasjon, som demonstrert i figur 2A, så mest sannsynlig modus snitt ikke fungerte bra. De to vanligste årsakene til dette er: 1) for få bilder tatt for å skape en gjennomsnittlig stabel og 2) for kort av en bevegelse avstand/for stor av en trinn størrelse. Samle for få bilder kan utelate noen eksitasjon mønstre og gjennomsnittet vil dermed bli inhomogen. Dette kan lett løses ved å øke antall bilder i den gjennomsnittlige stakken. For kort av en bevegelse avstand kan også føre til et inhomogen bilde, som ikke nok modus mønstre er spent. Dette kan også enkelt løses ved å øke avstanden mellom bevegelse og/eller redusere trinn størrelsen. I dette arbeidet har vi brukt en piezo scene for å skanne input laserstrålen over 20 μm og tilegne seg minst 300 bilder. En annen tilnærming kan være å bruke høyhastighets galvo-speil for å skanne lyset over input waveguide fasett innenfor en enkelt oppkjøp tid, for eksempel 10-30 MS. dette alternativet er egnet for Live celle TIRF Imaging, hvor sub-cellulære organeller er i konstant bevegelse.
Chip-basert dstorm tilbyr et enestående stort område TIRF eksitasjon, som gjør den ideell for høy gjennomstrømming Imaging. Den kompakte karakteren gir mulighet for ettermontering til kommersielle systemer, der brikken kan plasseres opp ned for invertert oppsett eller gjennomsiktige underlag kan utvikles. Sjetongene er masse fabrikkert og kan endres for å passe mange behov. Foreløpig er den viktigste begrensningen at det er begrenset til 2D. Den evanescent feltet er bare tilgjengelig ca 200 NM unna waveguide overflaten, så bare fluorophores innenfor denne regionen vil bli begeistret. Til sammen tilbyr feltet integrert optikk mange muligheter for chip-baserte mikroskopi i nær fremtid, ved å takle nye Imaging spørsmål samt gi nye muligheter til eksisterende.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne anerkjenne det europeiske forskningsråd (Grant no. 336716 til B.S.A.). Forfatterne vil også takke Irati Lagfragua for hennes uvurderlig hjelp med innspilling og redigering av video.
1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
Filter Holder | Homemade | ||
Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |