שיטת בימוי עצמי סטטי ליצירת אורגנואידים המוח מתאי גזע האדם העובריים
Summary
פרוטוקול זה נוצר כאמצעי לייצר אורגנואידים המוח באופן פשוט, עלות נמוכה ללא גורמי צמיחה אקסוגני או מטריקס קרום המרתף תוך שמירה על מגוון של סוגי תאי המוח ותכונות רבות של ארגון הסלולר.
Abstract
אורגנואידים המוח האנושי הבדיל מתאי גזע עובריים להציע את ההזדמנות הייחודית לחקור אינטראקציות מסובכות של סוגי תאים מרובים במערכת תלת ממדית. כאן אנו מציגים שיטה ברורה יחסית וזולה אשר מפיקה אורגנואידים במוח. בפרוטוקול זה האדם בתאי גזע רב עוצמה מנותקים לאשכולות קטנים במקום תאים בודדים גדל במדיה בסיסית ללא מטריצה הטרוולוגי מטריקס מטריצות או גורמי גדילה אקסוגניים, המאפשר רמזים התפתחותיים מהותי כדי לעצב את ה גידול של אורגאיד. מערכת פשוטה זו מייצרת מגוון של סוגי תאי המוח כולל התאים גליה ו microglial, בתאי גזע, ונוירונים של המוח הקדמי, אמצע המוח, ו הראש. אורגנואידים שנוצר מפרוטוקול זה גם להציג את הסימנים של הזמן המתאים וארגון מרחבית הפגינו על ידי תמונות ברייטפילד, היסטולוגיה, immunofluorescence ובזמן אמת הפוכה כמותית התגובה שרשרת פולימראז ( רביעיית-PCR). מכיוון שאורגנואידים אלה מכילים סוגי תאים מחלקים שונים של המוח, הם יכולים להיות מנוצלים ללימוד מספר רב של מחלות. לדוגמה, במאמר האחרון הדגמנו את השימוש באורגנואידים שנוצר מפרוטוקול זה לחקר ההשפעות של היפוקסיה על המוח האנושי. גישה זו יכולה לשמש כדי לחקור מערך של קשה אחרת ללמוד תנאים כגון מגבלות נוירולוגיים, הפרעות גנטיות, ומחלות נוירולוגיות.
Introduction
בשל מגבלות מעשיות ואתיות רבות, יש קושי רב בלימוד המוח האנושי. בעוד מחקרים ניצול מכרסמים היו קריטיים להבנה שלנו של המוח האנושי, המוח העכבר יש הרבה וני1,2. מעניין, עכברים יש צפיפות עצבית כי הוא לפחות 7 פעמים פחות מאשר המוח הפרימטים3,4. למרות הפרימטים קרובים יותר לבני אדם מאשר מכרסמים מבחינה אבולוציונית, זה לא מעשי עבור רוב החוקרים לעבוד איתם. המטרה של פרוטוקול זה היתה לסכם תכונות חשובות רבות של המוח האנושי באמצעות שיטה פשוטה וזולה יותר ללא צורך במרתף הטרוולוגי מטריקס קרום או גורמי צמיחה אקסוגני תוך שמירה על מגוון תאי המוח וארגון הסלולר.
עבודת המעצבים מן המעבדה sasai בשימוש סרום חופשי התרבות של embryoid גופים (sfebq) שיטה לייצר שני ותלת מימדי התאים העצביים מתאי גזע עובריים (escs)5,6. הרבה שיטות של אורגנואיד של המוח האנושי הלכו בדרך דומה יחסית של escs7,8. לעומת זאת, פרוטוקול זה מתחיל עם אשכולות של escs האדם הפרטי (hESCs), בדומה לשלבים הראשוניים של עבודה הזרע של מעבדות תומסון ו ג’אנג לפני שלבי הציפוי9,10 , כמו גם את השלב ההתחלתי של פרוטוקול המוח אורגנואיד של המעבדה pasca לפני התוספת של גורמי צמיחה אקסוגני11. מטריצות קרום מרתף (למשל, מטריצות) כבר נוצלו בפרוטוקולים מאורגאיד של המוח הרבים וזה הוכח להיות הגרדום האפקטיבי8. עם זאת, הנפוץ ביותר מטריצות קרום המרתף לא בא ללא סיבוכים כפי שהם שיתוף לטהר עם כמויות לא ידועות של גורמי גדילה עם אצווה לשונות אצווה במהלך הייצור12. בנוסף, מטריצות אלה יכולים לסבך את ההדמיה, ולהגדיל את הסיכון של זיהום ועלות.
בעוד מאורגנואידים המוח האנושי יכול לשמש כדי לענות על שאלות רבות, יש מגבלות מסוימות לזכור. עבור אחד, החל בתאי גזע עובריים, אורגנואידים דומה יותר למוח בוגר מאשר המוחות הישנים וככזה לא יכול להיות מודלים אידיאליים עבור מחלות המתרחשות בגיל הזקנה, כמו מחלת אלצהיימר. שנית, בעוד הפרוטוקול שלנו מצאו סמנים של המוח הקדמי, אמצע המוח התפתחות המוח אשר שימושיים כדי ללמוד את ההשפעה של טיפול או מחלה על תאים מאזורי מוח מרובים בהופעה, ניתן לעקוב אחר פרוטוקולים אחרים כדי להתרכז באזורי מוח ספציפיים13,14. לבסוף, הגבלה נוספת של מודלים אורגנואיד הוא זה של גודל, בעוד האורך הממוצע של המוח האנושי כ 167 מ”מ, אורגנואידים המוח עשה עם שימוש של עצבנות לגדול עד 4 מ”מ8 ואת האורגנואידים שנוצר על ידי פרוטוקול זה לגדול ל 1-2 מ”מ ידי 10 שבועות. למרות זאת, פרוטוקול זה מספק כלי חשוב לחקר רקמת המוח האנושי והאינטראקציה של סוגי תאים מרובים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדומה למודלים אורגנואיד אחרים, זוהי מערכת מלאכותית המגיעה עם מספר אזהרות. למרות שהיה אצווה קטנה וריאציה אצווה במונחים של רמות הביטוי הכולל, אורגנואידים בודדים הראו הבדלים. לדוגמה, המיקום של האזורים החיוביים של סוקס-2 לא היה זהה בכל אורגנואיד (איור 3). בעוד qPCR מתאים לחפש שינויים כול?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לליבת תאי הגזע של ייל (YSCC), ומרכז הסרטן של ייל (YCC) לסיוע. אנחנו מודים לד ר יונג קים. על סקירת הנוירופתולוגיה שלו עבודה זו נתמכה על ידי הרפואה הרגנרטיבית של קונטיקט הקרן, מארס של מטבעות המלך, ו nhlbi R01HL131793 (S.G.K.), מרכז הסרטן של ייל ואת אוניברסיטת ייל ביולוגיה אימון תוכנית nci CA193200 (אי) ומתנה נדיבה מוגבלת של יוסף ו . לוסיל מאסי
Materials
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
- Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
- Roth, G. . The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
- Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
