ヒト胚性幹細胞から脳オルガノイドを生成するための静的自己指向法
Summary
このプロトコルは、脳細胞の多様性と細胞組織の多くの特徴を維持しながら、外因性成長因子または基下膜マトリックスを用いることなく、単純化された低コストの方法で脳オルガノイドを生成する手段として生成された。
Abstract
胚性幹細胞から分化したヒト脳オルガノイドは、3次元系における複数の細胞型の複雑な相互作用を研究するユニークな機会を提供する。ここでは、脳オルガノイドを生み出す比較的簡単で安価な方法を紹介します。このプロトコルでは、ヒト多能性幹細胞は単一細胞の代わりに小さなクラスターに分割され、異種基圧膜マトリックスまたは外因性成長因子を持たない基礎培地で増殖し、本質的な発達の手掛かりを形作ることを可能にする。オルガノイドの成長。この単純なシステムは、グリア細胞やミクログリア細胞、幹細胞、前脳、中脳、後脳のニューロンなど、さまざまな脳細胞型を作り出します。このプロトコルから生成されたオルガノイドは、明視野画像、組織学、免疫蛍光およびリアルタイムの定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって示される適切な時間および空間組織の特徴を示す(qRT-PCR)。これらのオルガノイドは脳の様々な部分の細胞型を含んでいるので、多くの疾患の研究に利用することができます。例えば、最近の論文では、このプロトコルから生成されたオルガノイドを使用して、低酸素が人間の脳に及ぼす影響を研究する方法を実証しました。このアプローチは、神経発達障害、遺伝性疾患、神経疾患などの研究が困難な配列を調査するために使用することができます。
Introduction
無数の実用的および倫理的な制限のために、人間の脳を研究する上で非常に困難がありました。げっ歯類を利用した研究は人間の脳の理解にとって重要でしたが、マウスの脳には多くの異種があります。興味深いことに、マウスは霊長類脳3、4よりも少なくとも7倍少ないニューロン密度を有する。霊長類は進化的な観点からげっ歯類よりも人間に近いですが、ほとんどの研究者が一緒に働くのは現実的ではありません。このプロトコルの目的は、脳細胞の多様性と細胞組織を維持しながら、異種の基下膜マトリックスまたは外因性成長因子を必要とせずに、簡略化された安価な方法を使用して人間の脳の多くの重要な特徴を再現することであった。
サザイ研究室からの造形研究は、胚体の血清自由培養(SFEBq)法を用いて、シグナル化胚性幹細胞(ESC)5,6から2次元および3次元神経細胞型を生成した。多くのヒト脳オルガノイド法は、シグナル化されたESC7から比較的類似した経路をたどってきた、 8.対照的に、このプロトコルは、外因性成長因子11の追加前のパスカ研究所の脳オルガノイドプロトコルの初期段階と同様に、トムソンおよび張研究所の精液作業の初期段階と同様に、分離されたヒトESC(hESC)のクラスターから始まる。下地膜マトリックス(例えば、マトリゲル)は、多くの脳オルガノイドプロトコルに利用されており、有効な足場8であることが示されている。しかし、最も一般的に使用される基下膜マトリックスは、生産12のバッチ変動にバッチで未知の量の成長因子と共精製するので、合併症なしでは来ない。さらに、これらのマトリックスは、画像化を複雑にし、汚染およびコストのリスクを高めることができます。
人間の脳オルガノイドは多くの質問に答えるために使用することができますが、心に留心する特定の制限があります。一つには、胚性幹細胞から始まり、オルガノイドは老化した脳よりも未熟な脳によく似ているため、アルツハイマー病のような老年期に起こる疾患の理想的なモデルではない可能性があります。第二に、我々のプロトコルは、脳の前脳、中脳および後脳のマーカーを発見し、協調して複数の脳領域からの細胞に対する治療または疾患の効果を研究するのに有用であるが、他のプロトコルは、特定の脳領域13、14に集中するために従うことができる。最後に、オルガノイドモデルのもう一つの制限は、大きさのものであり、人間の脳の平均長さは約167mmであり、攪拌を用いて作られた脳オルガノイドは4mm8まで成長し、このプロトコルによって形成されたオルガノイドは1〜2週間に成長する。それにもかかわらず、このプロトコルは、ヒトの脳組織および複数の細胞型の相互作用を研究するための重要なツールを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
他のオルガノイドモデルと同様に、これはいくつかの注意点が付属している人工システムです。全体的な発現レベルの点でバッチ変動にバッチはほとんどなかったが、個々のオルガノイドは違いを示さなかった。例えば、Sox-2正の領域の位置は、すべてのオルガノイドで同一ではなかった(図3)。qPCRは細胞のバッチの全体的な変化を探すために適しているが、単一細胞RNAEqのような…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
エール幹細胞コア(YSCC)とエールがんセンター(YCC)の支援に感謝します。私たちは、彼の神経病理学のレビューのためにチョン・キム博士に感謝します。この研究は、コネチカット再生医療研究基金、ダイムズの行進、NHLBI R01HL131793(S.G.K.)、エールがんセンター、エールがん生物学トレーニングプログラムNCI CAI CA193200(E.B.)とジョセフからの寛大な無制限の贈り物によって支援されました。ルシール・マドリ
Materials
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
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