Summary

توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتوليد الهيكل الأساسي لبطانة الرحم البشرية الاوليه التي تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية والاحتفاظ بخصائص نسيج بطانة الرحم الأصلي. يصف هذا البروتوكول الطرق من اكتساب انسجه الرحم إلى المعالجة النسيجية لهيكل بطانة الرحم.

Abstract

بطانة الرحم البشرية هي واحده من الانسجه الأكثر استجابه هرمونيا في الجسم وضروري لأقامه الحمل. هذا النسيج يمكن أيضا ان تصبح مريضه وتسبب الاعتلال وحتى الموت. واقتصرت النظم النموذجية لدراسة بيولوجيا بطانة الرحم البشرية علي نظم الاستزراع الأنبوبي لأنواع الخلايا المفردة. الاضافه إلى ذلك ، فان الخلايا الظهاريه ، واحده من أنواع الخلايا الرئيسية لبطانة الرحم ، لا تنتشر بشكل جيد أو الاحتفاظ بصفاتها الفسيولوجية في الثقافة ، التالي فهمنا لعلم الاحياء بطانة الرحم لا يزال محدودا. لقد ولدت ، للمرة الاولي ، الهيكل التنظيمي لبطانة الرحم التي تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم البشرية. هذه العضوية لا تتطلب اي مواد سقالة الخارجية وتنظيم علي وجه التحديد بحيث الخلايا الظهاريه تشمل الهيكل الشبيه كروي وتصبح مستقطبه مع الخلايا اللحمية في المركز الذي ينتج وتفرز الكولاجين. يتم التعبير عن الاستروجين ، البروجسترون ومستقبلات الاندروجين في الخلايا الظهاريه واللحمية والعلاج مع المستويات الفسيولوجية من الاستروجين والتستوستيرون تعزيز تنظيم الهيكل التنظيمي. ويمكن استخدام هذا النظام نموذج جديد لدراسة البيولوجيا بطانة الرحم العادية والمرض بطرق لم تكن ممكنة من قبل.

Introduction

بطانة الرحم البشرية التجويف الرحمي وتعمل كاول اتصال للجنين اثناء الغرس. وتتكون بطانة الرحم من الخلايا الظهاريه المضيءه والغديه ، والخلايا الليفية الداعمة للورم ، والخلية البطانية والخلايا المناعية. معا, هذه الأنواع الخلية تشكل انسجه بطانة الرحم التي هي واحده من الانسجه الأكثر استجابه لهرمونات الستيرويد الجنس1. التغييرات التي تحدث خلال كل دوره الحيض ملفتة للنظر. مطلوب النمو المناسب وأعاده تشكيل بطانة الرحم للسماح لزرع الاجنه ان يحدث. الاستجابة الشاذة للاستروجين والبروجستيرون يمكن ان يؤدي إلى بطانة الرحم الحرارية التي لا تسمح للنجاح في إنشاء الحمل ويمكن ان يؤدي حتى في الامراض بما في ذلك أورام بطانة الرحم.

من أجل دراسة الاستجابات الهرمونية والتغييرات الاساسيه التي تحدث في بطانة الرحم ، تم نشر الخلايا من انسجه بطانة الرحم التي تم استئصالها من المرضي اثناء الجراحة أو خزعة بطانة الرحم في ثقافة الخلايا. تنتشر الخلايا اللحمية لبطانة الرحم بشكل تفضيلي وتنتشر بسهوله ، ويمكن تلخيص عمليه التمايز التي يسببها البروجسترون في المختبر. ونتيجة لذلك ، تم تعلم الكثير خلال عمليه التفريق هذه ، التي سميت ديسيدواليزيشن2،3. نوع الخلية الرئيسية الأخرى في بطانة الرحم ، والخلايا الظهاريه التلالؤ والغديه ، ومع ذلك ، لا تنمو بشكل جيد كما أحادي الطبقات التقليدية ، وفقدان القطبية ، وتصبح السكون ، ووجود إمكانات محدوده التكاثري. ونتيجة لذلك ، فان اقل ما يعرف عن علم الاحياء ودورها في بطانة الرحم البشرية. وبما ان العديد من الأورام تنشا من الخلايا الظهاريه ، تظل أليات المرتبطة بفرط التنسج أو التحول إلى الخلايا السرطانية محدده بالبالكامل. وعلاوة علي ذلك, وقد وضعت دراسات ان الاستجابة هرمون ينطوي علي الإجراءات الحميمة paracrine بين الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم4,5.

في الاونه الاخيره ، تم تاسيس الثقافة العضوية ثلاثية الابعاد (3d) من الخلايا الظهاريه بطانة الرحم من قبل مجموعتين مستقلتين6،7، والتي هي التقارير الاولي من العضوية التي تشكلت من انسجه بطانة الرحم. وتتالف هذه العضوية من الخلايا الظهاريه بطانة الرحم جزءا لا يتجزا من مصفوفة البروتين (جدول المواد) ولم تشمل مقصوره استجابه الهامه هرمونيا من بطانة رحم بطانة الرحم ، والليفية اللحمية. كما يمكن ان تختلف البروتينات مصفوفة من الكثير إلى الكثير ، ويمكن ان تؤدي إلى مسارات الإشارات التي لا تحدث بالضرورة في الانسجه ، فانه سيكون من المثالي لاستبدال البروتينات مصفوفة مع مكونات بطانة الرحم. في الدراسة الحالية ، يتم تقديم بروتوكول لتوليد الهيكل العضوي الخالي من السقالات من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم البشرية. وجود الخلايا اللحمية لا يوفر فقط الدعم للخلايا الظهاريه ولكنه يوفر أيضا الإجراءات الضرورية paracrine التي تم إنشاؤها لتكون مهمة لاستجابه هرمون بطانة الرحم4,8,9 .

العضوية الجديدة لبطانة الرحم متعددة الخلايا تقدم نظاما نموذجيا لبطانة الرحم التي هي بسيطه لتوليد والتي تتضمن كلا من الخلايا الظهاريه واللحمية. ويمكن استخدام هذه العضوية لدراسة التغيرات الهرمونية علي المدى الطويل والاحداث المبكرة من الامراض مثل التورم بسبب عدم التوازن الهرموني أو الشتائم الخارجية. ويمكن في نهاية المطاف توسيع تعقيد هذه الاشكال العضوية لتشمل أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الخلايا البطانية والمناعية مع الخلايا العضلية ربما إلى تقليد حقا فسيولوجيا الانسجه البشرية.

Protocol

تم جمع عينات بطانة الرحم من النساء قبل انقطاع الطمث التي خضعت لعمليه استئصال الرحم الروتينية لظروف رحميه حميده في مستشفي النساء بجامعه نورث وسترن ، وفقا لبروتوكول وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية. وتم الحصول علي موافقه خطيه من جميع النساء المشمولات بالدراسة. 1. اعداد قوالب ا…

Representative Results

ويرد في الشكل 1وصف تخطيطي للبروتوكول. تم الحصول علي انسجه الرحم من الجراحة بعد فحصها من قبل اخصائيي الامراض. وفصل بطانة الرحم من الورم العضلي عن طريق الكشط وتم هضم انسجه بطانة الرحم انزيمي إلى الخلايا كما هو موضح في البروتوكول. وأضيفت الخلايا الظهاريه واللحمية إلى ميكروويل…

Discussion

وقد ولدت لدينا الإنسان العضوي بطانة الرحم تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم دون استخدام مواد سقالة الخارجية. في حين انه قد تم بالفعل تبين ان الخلايا الظهاريه بطانة الرحم الاوليه يمكن ان تشكل organoids6,7, وقد تم تضمين هذه الخلايا في مصفوفة الجيلا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذه الدراسة من قبل NIHS/المعاهد القومية للصحة/NCATS UG3 غرانت (ES029073) وشمال غرب مدرسه Feinberg كليه الطب جسر الصندوق (JJK). نود ان نعترف بالمرفق الأساسي لعلم الامراض الشمالية الغربية لمعالجه العضوية الثابتة لتضمين البارافين. نود ان نعترف بالفريق UG3 بأكمله بما في ذلك وودروف ، Burdette ، ومختبرات اوربريك للمناقشات الثاقبة والتعاون.

Materials

Agarose HS, molecular biology grade Denville Scientific CA3510-6
Agarose molds Sigma-Aldrich Z764043 (https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl) Amresco 0621
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2257
Collagenase, Type II, powder Thermo Fisher Scientific 17101015
Dispase Corning 354235
DNase I Sigma-Aldrich D4513
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Eosin Stain VWR 95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium Sigma-Aldrich F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution Thermo Fisher Scientific 3530-32 Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution STEMCELL Technologies 07980 added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution STEMCELL Technologies 07925 added to MammoCult media
Organoid media – Mammocult STEMCELL Technologies 05620 supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant Agilent Technologies M356801-2
protein matrix – Matrigel BD Biosciences 356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody BD Biociences 610181 Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] Abcam ab92547
RNA lysis and isolation kit Zymo Research R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Testosterone Sigma-Aldrich 86500
Trichrome Stain Abcam ab150686
Wax film – Parafilm VWR 52858-000

References

  1. Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
  2. Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
  3. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
  4. Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
  5. Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
  6. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  7. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  8. Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
  9. Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
  10. Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
  11. Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).

Play Video

Cite This Article
Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).

View Video