جيل من الخنازير الخصيتين مع الهندسة المعمارية الخاصة بالخصية باستخدام الثقافة Microwell
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا للجيل القابل للاستنساخ من الخصية الوركية مع بنيه نسيجيه خاصه بالخصية باستخدام نظام الاستزراع المجهري المتوفر تجاريا.
Abstract
Organoids هي ثلاثه هياكل الابعاد تتالف من أنواع الخلايا المتعددة التي هي قادره علي تلخيص هندسه الانسجه ووظائف الأعضاء في الجسم المجري. وقد فتحت تشكيل الهيكل التنظيمي سبلا مختلفه للبحوث الاساسيه والانتقالية. في السنوات الاخيره ، وقد حصلت organoids الخصية الاهتمام في مجال البيولوجيا الانجابيه الذكور. الخصية العضوية تسمح للدراسة من التفاعلات خليه الخلية ، وتطوير الانسجه ، والخلية الجرثومية البيئة الدقيقة المتخصصة وتسهيل الانتاجيه العالية المخدرات والسمية الفرز. وهناك حاجه إلى طريقه موثوق بها والتكرار توليد العضوية الخصية مع الهيكل الانسجه المحددة الخصية. يحتوي نظام الثقافة microwell علي مجموعه كثيفه من ميكروويلس علي شكل هرم. خلايا الخصية المستمدة من الخصيتين قبل البلوغ طرد في هذه الميكروويلس ومثقف لتوليد organoids الخصية مع البنية الانسجه الخاصة بالخصية والجمعيات الخلية. يمكن توليد آلاف من العضويات المتجانسة عبر هذه العملية. سيكون البروتوكول المذكور هنا موضع اهتمام واسع للباحثين الذين يدرسون تكاثر الذكور.
Introduction
في السنوات الاخيره ، كان هناك تجدد الاهتمام في ثلاثي الابعاد (3D) الهيكل التنظيمي. وقد تم اشتقاق أجهزه مختلفه مثل الأمعاء1، المعدة2، البنكرياس3،4، الكبد5، والدماغ6 بنجاح إلى أنظمه organoid 3d. هذه العضوية لديها أوجه التشابه المعمارية والوظيفية للأعضاء في الجسم الحيوي وأكثر اهميه بيولوجيا لدراسة البيئة المجهرية الانسجه من النظم الثقافية أحاديه الطبقة7. ونتيجة لذلك ، وقد بدات organoids الخصية لكسب الفائدة كذلك8،9،10،11،12. معظم الطرق المبلغ عنها حتى الآن هي معقده, غير عاليه الانتاجيه10 وتتطلب أضافه البروتينات ECM8,10. هذا التعقيد يؤدي أيضا إلى مشاكل مع استنساخ. وهناك حاجه إلى طريقه بسيطه وقابله للاستنساخ التي تسمح للجيل من الخصية العضوية مع الجمعيات الخلية التي هي مثل الخصية في الجسم الفيفو.
وقد أبلغنا مؤخرا عن نظام لمعالجه هذه المتطلبات12. باستخدام خنزير كنموذج ، استخدمنا الطرد المركزي القسري نهج التجميع في نظام microwell. في ال [ميكروسس] نظامه, يحتوي كل بئر [ا لرج نومبر] من متماثلة صغيره ميكروويلس13. هذا يسمح للجيل من يتعدد خزان من حجم متسقة. وقد مكن نظام microwell من توليد اعداد كبيره من الهيكل التنظيمي الموحد مع بنيه خاصه بالخصية. النظام بسيط ولا يتطلب أضافه بروتينات ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد انشانا طريقه بسيطه تسمح للجيل متسقة وقابله للتكرار من اعداد كبيره من organoids الخصية مع الهندسة المعمارية الانسجه التي تشبه الخصية في الجسم المجري12. في حين تم تطوير النهج باستخدام خلايا الخصية الخنازير ، فانه ينطبق علي نطاق أوسع أيضا علي الماوس ، الرئيسيات غير البشرية والخص?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة/NICHD HD091068 إلى الدكتورة أينا Dobrinski.
Materials
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).
- Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. , (2019).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).
- Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).
