Synthese von Nahinfrarot emittierenden Gold-Nanoclustern für biologische Anwendungen
Summary
Beschrieben wird eine zuverlässige und leicht reproduzierbare Methode zur Herstellung funktionalisierbarer, nahininiert emittierender photolumineszierender Gold-Nanocluster und deren direkter Detektion in HeLa-Zellen durch Durchflusszytometrie und konfokale Laserscanmikroskopie.
Abstract
In den letzten zehn Jahren haben fluoreszierende Gold-Nanocluster (AuNCs) eine wachsende Popularität in biologischen Anwendungen erlebt, und enorme Anstrengungen wurden für ihre Entwicklung unternommen. In diesem Protokoll wurde eine kürzlich entwickelte, einfache Methode zur Herstellung von wasserlöslichen, biokompatiblen und kolloidstabilen AuNCs mit Nahinfraroteund im Detail beschrieben. Diese chemische Synthese mit Raumtemperatur und Bottom-up-Gehalt bietet leicht funktionsiierbare AuNCs, die mit Thioctsäure und Thiol-modifiziertem Polyethylenglykol in wässriger Lösung einzuschließen sind. Der synthetische Ansatz erfordert weder organische Lösungsmittel oder zusätzlichen Ligandenaustausch noch umfassende Kenntnisse der synthetischen Chemie, um sich zu vermehren. Die resultierenden AuNCs bieten freie Oberflächencarbonsäuren, die mit verschiedenen biologischen Molekülen funktionalisiert werden können, die eine freie Amingruppe tragen, ohne die photolumineszierenden Eigenschaften der AuNCs zu beeinträchtigen. Ein schnelles, zuverlässiges Verfahren zur zytometrischen Durchflussquantifizierung und konfokale mikroskopische Bildgebung der AuNC-Aufnahme durch HeLa-Zellen wurde ebenfalls beschrieben. Aufgrund der großen Stokes-Verschiebung ist eine korrekte Einstellung von Filtern in der Durchflusszytometrie und konfokalen Mikroskopie für die effiziente Detektion der Nahinfrarot-Photolumineszenz von AuNCs erforderlich.
Introduction
In den letzten zehn Jahren haben sich ultrakleine photolumineszierende Gold-Nanocluster (PL AuNCs) als vielversprechende Sonden sowohl für die Grundlagenforschung als auch für praktische Anwendungen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Zu ihren vielen wünschenswerten Eigenschaften gehören hohe Photostabilität, abstimmbare Emissionsmaxima, lange Emissionslebensdauern, große Stokes-Verschiebungen, geringe Toxizität, gute Biokompatibilität, Renalclearance und einfache Biokonjugation. PL AuNCs können Photolumineszenz von der blauen bis zur Nahinfrarot -Spektralregion (NIR) bereitstellen, abhängig von der Anzahl der Atome innerhalb des Clusters11 und der Art des Oberflächenliganden12. NIR (650-900 nm) emittierende AuNCs sind besonders vielversprechend für die langfristige In-vitro- und In-vivo-Bildgebung von Zellen und Geweben, da sie ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufgrund minimaler Überlappung mit intrinsischer Autofluoreszenz, schwächerer Streuung und Absorption und hoher Gewebedurchdringung von NIR-Licht13,14bieten.
In den letzten Jahren wurden verschiedene Ansätze entwickelt, die die kovalenten Wechselwirkungen von Au-S nutzen, um NIR-PL AuNCs vorzubereiten, die mit einer Vielzahl von thiolhaltigen Liganden13,15,16,17gekrönt sind. Für biomedizinische Anwendungen müssen AuNCs mit einer biologischen Komponente funktionalisiert werden, um Bindungswechselwirkungen zu erleichtern. Daher sind AuNCs mit hoher kolloidaler Stabilität, die in wässrigem Lösungsmittel leicht funktionalisierbar sind, sehr wünschenswert. Das übergeordnete Ziel des aktuellen Protokolls besteht darin, eine zuvor gemeldete18 Zubereitung von AuNCs mit einer funktionalisierbaren Carbonsäuregruppe an der Oberfläche zu beschreiben, indem Thioctic acid und Polyethylenglykol (PEG) in einer wässrigen Umgebung im Detail eingesetzt werden und ihre Konjugation mit Molekülen, die ein primäres Amin nach dem Säure-Amin-Kopplungsverfahren tragen. Aufgrund der einfachen Synthese und hohen Reproduzierbarkeit kann dieses Protokoll von Forschern aus nicht-chemischen Hintergründen verwendet und angepasst werden.
Eine der wichtigsten Voraussetzungen für Anwendungen von AuNCs in der biomedizinischen Forschung ist die Fähigkeit, AuNCs in Zellen zu beobachten und zu messen. Unter den verfügbaren Methoden zur Überwachung der Nanopartikelaufnahme durch Zellen bieten durchFlusszytometrie (FCM) und konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) robuste, hochdurchsatzige Methoden, die schnelle Messungen der Internalisierung fluoreszierender Nanomaterialien in einer großen Anzahl von Zellen ermöglichen19. Hier wurden auch FCM- und CLSM-Verfahren zur direkten Messung und Analyse von PL AuNCs in Zellen vorgestellt, ohne dass zusätzliche Farbstoffe erforderlich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
NIR-emittierende AuNCs wurden mit einem Bottom-up-Ansatz synthetisiert, bei dem die Goldvorläuferlösung (HAuCl4) mit geeigneten Thiolligaden behandelt wurde, gefolgt von einer Reduktion von Au3+. Die Reduktion von Metallionen in wässriger Lösung neigt dazu, sich zu aggregieren und führt eher zu großen Nanopartikeln als zu ultrakleinen NCs21. Um ultrakleine PL-AuNCs zu erstellen, wurden die synthetischen Bedingungen angepasst, um die Bildung großer Partikel zu verhinder…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind Alzbeta Magdolenova für ihre Hilfe bei der Durchflusszytometrie dankbar. Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch das GACR-Projekt Nr. 18-12533S. Mikroskopie wurde im Labor für Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, das vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung und dem Staatshaushalt der Tschechischen Republik kofinanziert wird. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 und CZ.2.16/3.1.00/21515 und unterstützt durch das tschechisch-bioImaging große RI-Projekt LM2015062.
Materials
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
| DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
| Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
| Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
| Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
| Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
| Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
| Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
| XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |
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