JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생체공학

Síntese de nanoaglomerados de ouro emissor próximos para aplicações biológicas

Published: March 22, 2020
doi:
10.3791/60388
, , , , , ,
1Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, 2Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics,Charles University, 3Department of Cell Biology, Faculty of Science,Charles University, 4First Faculty of Medicine,Charles University

Summary

Um método confiável e facilmente reprodutível para a preparação de nanoaglomerados de ouro fotoluminescentes funcionais e quase infravermelhos e sua detecção direta dentro das células HeLa por citometria de fluxo e microscopia de varredura a laser confocal é descrito.

Abstract

Na última década, os nanoaglomerados de ouro fluorescentes (AuNCs) testemunharam uma crescente popularidade em aplicações biológicas e enormes esforços foram dedicados ao seu desenvolvimento. Neste protocolo, um método recentemente desenvolvido e fácil para a preparação de AuNCs emissores de água solúveis, biocompatíveis e coloides estáveis perto do infravermelho foram descritos em detalhes. Esta síntese química de baixa temperatura fornece AuNCs facilmente funcionalizáveis tampados com ácido tlástico e glicol de polietileno modificado por tiol em solução aquosa. A abordagem sintética não requer solventes orgânicos ou troca de ligantes adicionais, nem amplo conhecimento de química sintética para se reproduzir. Os AuNCs resultantes oferecem ácidos carboxílicos de superfície livre, que podem ser funcionalizados com várias moléculas biológicas com um grupo de amina livre sem afetar adversamente as propriedades fotoluminescentes dos AuNCs. Também foi descrito um procedimento rápido e confiável para quantificação citométrica de fluxo e imagens microscópicas confocais da captação de AuNC por células HeLa. Devido à grande mudança de Stokes, a configuração adequada dos filtros na citometria de fluxo e microscopia confocal é necessária para a detecção eficiente da fotoluminescência quase infravermelha dos AuNCs.

Introduction

Na última década, nanoaglomerados de ouro fotoluminescentes (PL AuNCs) emergiram como sondas promissoras tanto1para pesquisas fundamentais quanto para aplicações práticas1,2,,33,4,,55,6,,7,,8,,9,,10. Suas muitas características desejáveis incluem alta fotosestabilidade, máxima de emissões ajustáveis, longas vidas de emissões, grandes mudanças de Stokes, baixa toxicidade, boa biocompatibilidade, liberação renal e bioconjugação fácil. Os AuNCs pl podem fornecer fotoluminescência do azul à região espectral quase infravermelha (NIR), dependendo do número de átomos dentro do aglomerado11 e da natureza do ligante de superfície12. NIR (650-900 nm) emissores de AuNCs são particularmente promissores para imagens in vitro e in vivo de longo prazo de células e tecidos, pois oferecem alta relação sinal-ruído devido à sobreposição mínima com autofluorescência intrínseca, dispersão e absorção mais fracas e alta penetração tecidual da luz NIR13,14.

Nos últimos anos, várias abordagens que se aproveitam das interações covalentes Au-S foram desenvolvidas para preparar AuNCs NIR-PL tampados com uma variedade de ligantes contendo tiol13,,15,16,17. Para aplicações biomédicas, os AuNCs devem ser funcionalizados com um componente biológico para facilitar interações de ligação. Assim, AuNCs com alta estabilidade coloidal que são facilmente funcionais em solvente aquoso são altamente desejáveis. O objetivo geral do protocolo atual é descrever uma preparação previamente relatada de18 AuNCs com um grupo de ácido carboxílico funcionalizável na superfície, empregando ácido tiocitico e polietileno glicol (PEG) em um ambiente aquoso em detalhes e sua conjugação com moléculas com uma amina primária seguindo o método de acoplamento ácido-aminado. Devido à facilidade de síntese e alta reprodutibilidade, este protocolo pode ser usado e adaptado por pesquisadores de origens não químicas.

Um dos principais requisitos para aplicações de AuNCs em pesquisas biomédicas é a capacidade de observar e medir AuNCs dentro das células. Entre os métodos disponíveis para monitorar a captação de nanopartículas por células, a citometria de fluxo (FCM) e a microscopia de digitalização a laser confocal (CLSM) oferecem métodos robustos e de alto desempenho que permitem medições rápidas de internalização de nanomateriais fluorescentes em grande número de células19. Aqui, também foram apresentados métodos FCM e CLSM para medição direta e análise de PL AuNCs dentro das células, sem a necessidade de corantes adicionais.

Protocol

1. Preparação de AuNCs emissores de infravermelho próximos (1) Adicione 7,8 mg (37,8 μmol) ácido tlárico (TA) e 60 μL de 2 M NaOH a 23,4 mL de água ultrapura (resistividade 18,2 MΩ.cm a 25 °C) e mexa (pelo menos 1.000 rpm) até dissolver completamente (~15-20 min). Para uma dissolução mais rápida de TA, sônica a mistura. Para a síntese, recomenda-se a solução TA recém-preparada. Adicionar 10,2 μL de HAuCl4·3H2O (470 mg/mL) de solução aquosa para a solução….

Representative Results

NIR PL AuNCs foram preparados a partir de Au3+ na presença de TA, e então o PEG (MW 2.000) foi vinculado à superfície AuNC para obter 1 após o fluxo de trabalho mostrado na Figura 1. Acoplamento amidiano entre 1 e 3(aminopropílico) brometo de tripenylfosfonia (TPP) fornecido 2. Como esperado, os espectros de absorção (Figura 2a) indicaram que os AuNCs 1 e 2 n?…

Discussion

Os AuNCs emissores de NIR foram sintetizados utilizando-se uma abordagem de baixo para cima na qual a solução precursora de ouro (HAuCl4) foi tratada com ligantes thiol adequados, seguida de redução de Au3+. A redução de íons metálicos em solução aquosa tende a agregar e resulta em nanopartículas grandes em vez de NCs ultrapequenas21. Para preparar os AuNCs PL ultrapequenos (≤2 nm), as condições sintéticas foram ajustadas para evitar a formação de grandes pa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Alzbeta Magdolenova por sua ajuda com a citometria do fluxo. Os autores reconhecem o apoio financeiro do projeto GACR nº 18-12533S. A microscopia foi realizada no Laboratório de Microscopia Confocal e Fluorescência co-financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional e pelo orçamento estadual da República Tcheca, projetos nº. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 e CZ.2.16/3.1.00/21515, e apoiado pelo projeto de RI de grande bioimagem tcheca-bioimagem LM2015062.

Materials

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
  2. Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  3. Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
  4. Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
  5. Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry – An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
  6. Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
  7. Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
  8. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
  9. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
  10. Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
  11. Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
  12. Wu, Z., Jin, R. On the Ligand’s Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
  13. Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
  14. Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
  15. Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
  16. Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
  17. Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
  18. Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
  19. Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
  20. Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
  21. Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
  22. Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
  23. Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
  24. Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
  25. Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
  26. Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
  27. Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
  28. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
  29. Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
  30. Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
  31. Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
  32. Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
  33. Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
  34. Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
  35. Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
  36. Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
  37. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  38. Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
  39. Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
  40. Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
  41. Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
  42. Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).

Tags

Gold NanoclustersNear-infrared EmittingPhotoluminescentThiol-functionalized LigandAmine-functionalized LigandBiosensingBio-imagingUltrafiltrationPolyethylene GlycolEDC HCLCell Culture
check_url/kr/60388?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image