내인성 IRF5 이분화의 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기동동면역블롯 분석

Summary

CAL-1 혈장세포세포주에서 내인성 인터페론 조절 인자 5 이량화를 분석하기 위한 네이티브 웨스턴 블롯 방법이 기재되어 있다. 이 프로토콜은 다른 세포주에도 적용될 수 있습니다.

Abstract

인터페론 조절 인자 5(IRF5)는 면역 반응을 조절하기 위한 주요 전사 인자이다. 그것은 톨-유사 수용체 골수성 분화 1차 반응 유전자 88(TLR-MyD88) 신호 통로의 하류로 활성화된다. IRF5 활성화는 세포질에서 핵으로의 인산화, 이량화 및 후속 전좌를 수반하며, 이는 차례로 다양한 염증성 사이토카인의 유전자 발현을 유도한다. IRF5 활성화를 위한 검출 분석은 IRF5 기능 및 관련 경로를 연구하는 데 필수적입니다. 본 문서에서는 CAL-1 인간 혈장세포 수지상세포(pDC) 라인에서 내인성 IRF5 활성화를 검출하는 강력한 분석법들을 기술한다. 이 프로토콜은 단량체 및 이량체 형태로 IRF5를 구별할 수 있는 변형된 비분진 전기 동공 분석법으로 구성되어 IRF5 활성화를 분석하는 저렴하고 민감한 접근 방식을 제공합니다.

Introduction

인터페론 조절 인자 5(IRF5)는 면역 반응 조절에 중요한 전사 조절제이며, 특히 염증성 사이토카인 및 I형 인터페론(IFN)의 방출에서 특히 두드러진 역할을^{합니다. ,3}. IRF5의 오질은 전신 성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 등과 관련된 IRF5 궤적의 다양한 다형성에 의해 명백한 바와 같이 수많은 자가면역 질환에 기여하는 요인입니다^{4. 5,6},^7,8,9,10. 따라서, 내인성 IRF5 활성화 상태에 대한 강력한 검출 분석은 생리학적으로 관련된 세포 맥락에서 IRF5의 조절 경로 및 다운스트림 효과를 이해하는 데 매우 중요하다.

IRF5는 ....

Protocol

참고: 여기서 설명된 프로토콜은 TLR7/8의 작용제인 resiquimod(R848)로 처리된 CAL-1 pDC 세포주를 사용합니다. 본 프로토콜은 RAW 264.7(뮤린 대식세포선), THP-1(인간 단핵세포주), BJAB(인간 B 세포주), 라모스(인간 B 세포주), 및 MUTZ-3(인간 수지상^{세포주)를}포함하는 다른 인간 및 뮤린 세포유형에 적용되었다.

1. CAL-1 세포의 자극

1. 37°C에서 T75 플라스크에서 CAL-1 세포 배양물을 37°C및 5%_CO2의 멸균 조건에서 RPMI 1640 배지의 5% 태아 소 혈청(FBS), 25 mM HEPES 및 1x 메르카프토에탄올(즉, 완전한 RPMI 1640 배지)을 함유합니다.
2. 세포를 50 mL 원엽 튜브로 옮김.
   참고: CAL-1 세포는 부착되지 않습니다. 부착 세포 유형의 경우, 표준 트립시니화는 세포를 수확하기 위해 수행 될 수있다.
3. 실온(RT)에서 5분 동안 200 x g의 세포를 원심분리합니다. 상온액을 제거하고 완전한 RPMI 1640 배지의 8 mL에서 세포 펠릿을 재중단하여 균일한 ....

Results

항-IRF5 항체를 가진 면역블롯(IB)을 2시간 동안 1 μg/mL R848로 자극하거나 자극하지 않은 CAL-1 세포상에서 수행하였다(도1). 세포 리세이츠를 제조하였고, 네이티브 PAGE를 수행하였다. 자극되지 않은 CAL-1 세포에서, IRF5는 네이티브 PAGE상에서 단일 대역으로서 검출되었고, 그 단일체형 형태에 상응하였다. 2 시간 동안 R848로 CAL-1 세포를 치료하면 IRF5 단량체의 수준은 IRF5의 디메라 형태에 상응하는 천천히 이동하는 밴드의 축적의 동시 증가와 함께 감소하였다.

그림 1: TLR7/8 작용제로 자극했을 때 CAL-1 세포에서 내인성 IRF5이 이량화되었다.

Discussion

여기서 설명된 프로토콜은 내인성 IRF5의 단일및 다이메라체 형태를 모두 구별하는 수정된 네이티브 PAGE이다. 전문 적인 화상 진찰 교류 세포분석 기술^{23,27,28,30를}사용하여 내인성 IRF5 활성화의 검출을 보고하는 몇몇 연구 결과가 있었습니다. 이 프로토콜은 일반적인 기술과 일반적인 시약 및 도구를 사용하여 활성화의 초기 이벤트 동안 내인성 IRF5 활성화 상태를 평가합니다. 이 프로토콜은 IRF5의 단일체체 형태와 디메릭 형태를 구분할 수 있도록 표준 네이티브 PAGE 프로토콜을 간단하게 수정해야 합니다. 다른^{세포주(23)를}이용한 연구에 쉽게 적응할 수 있다. 이러한 변형된 네이티브 PAGE 프로토콜은 비특이적 단백질 간섭 없이 두 가지 형태로 내인.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-메르캅토에탄올	Life Technologies, HK	21985023
300 W/250 V 전원 공급 장치 230 V AC	Life Technologies, HK	PS0301
Anti-IRF5 항체	Bethyl Laboratories, USA	A303-385
BIOSAN Rocker Shaker (Cold Room Safe)	EcoLife, HK	MR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL	Life Technologies
글리세롤 500 mL	Life Technologies	15514011
Glycine	Life Technologies, HK	15527013
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody	LAB-A-PORTER/Rockland, HK	610-145-002-0.5
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody	LAB-A-PORTER/Rockland, HK	611-145-002-0.5
Halt 프로테아제 억제제 칵테일 (100x)	Thermo Fisher Scientific, HK	78430
HEPES	Life Technologies, HK	15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS)	Gene Company, HK	927-50000
Mini Tank blot module combo; 전송 모듈, 액세서리	Life Technologies, HK	NW2000
NativePAGE 3-12% 겔, 10웰 키트	Life Technologies, HK	BN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20x	Life Technologies, HK	BN2001
NativePAGE Sample Buffer 4x	Life Technologies, HK	BN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol	Tin Hang/ Calbiochem, HK#	492016-100ML
PBS 7.4	Life Technologies, HK	10010023
폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인	Bio-gene/Merck Millipore, HK	IPFL00010
단백질 분석 키트 II(BSA)	Bio-Rad, HK	5000002
R848	Invivogen, HK	tlrl-r848
RPMI 1640	Life Technologies, HK
염화나트륨	ThermoFisher	BP358-1
나트륨 데옥시콜레이트 ≥ 97% (적정)	Tin Hang/Sigma, HK	D6750-100G
Tris	Life Technologies, HK	15504020
TWEEN 20	Tin Hang/Sigma, HK	#P9416-100ML