우리는 세포 스페로이드를 재배 할 수있는 모터 구동 원심 미세 유체 장치를 제시합니다. 이 장치를 사용하여, 단일 또는 다중 세포 모형의 스페로이드는 높은 중력 조건 하에서 쉽게 cocultured 될 수 있었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
3차원 스페로이드 세포 배양은 2차원 세포 배양보다 생체의 세포 미세 환경을 더 잘 시뮬레이션할 수 있기 때문에 세포 실험에서 더 유용한 결과를 얻을 수 있다. 이 연구에서는 높은 원심력을 구현하는 3차원(3D) 세포 스페로이드를 만들기 위해 원심 미세유체 기반 스페로이드(CMS) 배양 시스템이라고 하는 전기 모터 구동 실험실 온 어 CD(소형 디스크) 플랫폼을 제작했습니다. 이 장치는 회전 속도가 다양하여 1 x g에서 521 x g까지의 중력 조건을 생성할 수 있습니다. CMS 시스템은 직경이 6cm이며, 100 400 μm 마이크로웰을 가지고 있으며, 컴퓨터 수치 제어 기계에 의해 미리 만들어진 폴리 카보네이트 금형에서 폴리 디메틸 실록산으로 성형하여 만들어집니다. CMS 시스템의 채널 입구의 장벽은 원심력을 사용하여 칩 내부에 세포를 고르게 퍼질 수 있습니다. 채널의 끝에는 세포가 마이크로웰에 들어갈 수 있는 슬라이드 영역이 있습니다. 시연으로, 스페로이드는 시스템을 사용하여 높은 중력 조건 하에서 인간 지방 유래 줄기 세포 및 인간 폐 섬유아세포의 단일 배양 및 공동 배양에 의해 생성되었다. CMS 시스템은 동심, 야누스 및 샌드위치의 다양한 구조의 공동 배양 스페로이드를 생산하기 위해 간단한 작업 방식을 사용했습니다. CMS 시스템은 단일 또는 다중 세포 유형의 스페로이드 및 오르가노이드 배양을 필요로 하는 세포 생물학 및 조직 공학 연구에서 유용할 것입니다.
서론
2차원(2D) 세포 배양(예: 기존의 페트리 접시 세포 배양)보다 3차원(3D) 스페로이드 세포 배양으로 생체 내 미세 환경을 시뮬레이션하여 보다 생리적으로 현실적인 실험을 생성하는 것이 더 쉽습니다. 결과1. 현재 이용 가능한 스페로이드 형성 방법은 매달려 낙하 기술2,액체 오버레이 기술3,카르복시메틸 셀룰로오스 기술4,자기 힘 기반 미세 유체 기술5,및 의 사용을 포함한다 생물 반응기6. 각 방법은 고유한 이점이 있지만 재현성, 생산성 및 공동 배양 스페로이드 생성의 추가 개선이 필요합니다. 예를 들어, 자기력 기반 미세 유체 기술5는 상대적으로 저렴하지만 살아있는 세포에 대한 강한 자기장의 영향을 신중하게 고려해야합니다. 스페로이드 배양의 이점은, 특히 중간엽 줄기세포 분화 및 증식의 연구에서, 여러 연구에서7,8,9에보고되었....
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프로토콜
1. 원심 미세 유체 기반 의 스페로이드 (CMS) 배양 칩 제조
- CNC 가공에 의해 CMS 배양 칩의 상부 및 하부 레이어용 PC 금형을 만듭니다. 칩의 자세한 치수는 그림 1에있습니다.
- PDMS 베이스와 PDMS 경화제를 10:1(w/w)의 비율로 5분 동안 혼합하고 기포를 제거하기 위해 1시간 동안 건조기안에 놓습니다.
- CMS 배양 칩의 금형에 PDMS 혼합물을 부은 후, 기포를 1시간 더 제거하고 80°C에서 2시간 동안 열 챔버에서 경화한다.
- 면이 위로 향하도록 표면이 있는 진공 플라즈마 클리너에 놓고 30s용 18W의 힘으로 공기 보조 플라즈마에 노출시십시오.
- CMS 배양 칩의 두 층을 결합하고 접착 강도를 높이기 위해 30 분 동안 80 °C의 열 챔버에 놓습니다.
- 121°C 및 15psi에서 오토클레이브 소독기에서 CMS 배양 칩을 살균합니다.
2. 세포 준비
- 5× 105-1×106 hASCs 또는 MRC-5s 세포를 함유하는 바이알의 1 mL을 36.5°C에서 수조에서 2분 동안 해동한다. ....
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결과
6 cm 직경 CMS 배양칩(도 2)은상기 프로토콜에 따라 성공적으로 이루어졌다. 먼저, 칩을 상부 층 및 하부 층으로부터 별도로 만든 다음 플라즈마 결합에 의해 함께 결합하였다. 생성 된 스페로이드는 칩을 분리하여 쉽게 수집 할 수 있습니다. CMS 배양 칩의 채널은 입구 포트및 중앙, 슬라이드 및 마이크로웰 영역을포함한다(도 3). 세포, 배지 및 플루로닉 솔루션은 직경 5 mm의 입구 구멍을 통해 주입됩니다. 주입된 세포는 입구 포트 영역에서 재서스펜션 3-5x에 의해 고르게 분포된다. 세포는 중앙 지역에서 원심력을 받고 바깥쪽으로 퍼질 수 있습니다. 중앙 영역은 마이크로웰보다 높기 때문에 더 많은 매체를 포함할 수 있으므로 스페로이드가 더 오래 생존할 수 있습니다. 마이크로웰의 높이는 0.4 mm이고 중앙 영역의 높이는 1.5 mm입니다. 흡입 구멍은 내부 용액을 쉽게 제거하기 위해 중앙 영역의 중심에 존재한다. 슬.......
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토론
CMS는 모든 주입 된 세포가 폐기물없이 마이크로 웰에 들어가는 폐쇄 시스템으로 기존의 마이크로 웰 기반 스페로이드 생성 방법보다 효율적이고 경제적입니다. CMS 시스템에서, 매 12-24시간마다 칩 내의 매체를 제거하도록 설계된 흡입 구멍을 통해 미디어가 교체된다(도3A). 미디어 흡입 과정에서, 거의 모든 매체는 마이크로웰의 매체와 벽 사이의 표면 장력으로 인해 마이크로웰 내부에서 빠져나오게 됩니다. PDMS로 만들어진 칩이 탄성및 유연하기 때문에 사용자는 손가락으로 칩의 마이크로웰 영역 근처를 눌러 트랩된 미디어를 쉽게 제거할 수 있습니다. 마이크로웰의 세포는 여러 개의 미디어 변경에도 불구하고 이스케이프없이 안정적으로 유지됩니다. 모든 100 마이크로웰에서 동일한 스페로이드 품질을 얻으려면 장치의 회전이 편심이 아니어야하며 칩은 축대칭이어야합니다. 그렇지 않으면, 세포의 가변 수는 각 우물을 입력할 수 있고 스페로이드의 크기 및 모양은 다를 수 있습니다. 종래의 마이크.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 연구는 NRF의 기초 과학 연구 프로그램(2016R1D1A1A1A1B0333418)과 NRF의 바이오 및 의료 기술 개발 프로그램(2018M3A9H1023141)에 의해 지원되었으며, 한국 정부, MSIT의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3D 프린터 | Cubicon | 3DP-210F | |
| 지방 유래 중간엽 줄기세포(hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| 항생제-항진균제 | Gibco | 15240-062 | 완성된 배지 및 완충액 1% 함유 |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10mM |
| 컴퓨터 수치 제어(CNC) 로터리 인그레이버 | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC 모터 | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D 컴퓨터 지원 설계 프로그램 | |
| 페트리 접시 및 Phi; 150mm | JetBiofill | CAD010150 | 표면 처리 |
| 플라즈마 세정 | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | 인산염 완충 식염수를 4%(w/v) 용액 |
| 폴리카보네이트(PC) | 아크릴몰 | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| 폴리디메틸실록산(PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
참고문헌
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing usi....
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재인쇄 및 허가
