في المختبر إنشاء خط الخلايا السرطانية للراس والرقبة المهندسة جينيا باستخدام نظام كاس 9 الفيروسات المرتبطة Adeno
Summary
مطلوب تطوير نماذج murine مع جينات محدده تحور في مرضي سرطان الراس والرقبة لفهم الأورام. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول للتحول في المختبر من خلايا اللسان الاوليه murine باستخدام نظام الفيروسات المرتبطة adeno-كاس 9 لتوليد murine الخلايا HNC خطوط مع التعديلات الجينية محدده.
Abstract
استخدام الخلايا الظهاريه العادية الاوليه يجعل من الممكن التكرار الحث علي التغييرات الجينية اللازمة للتحول الخلوي من خلال إدخال طفرات محدده في الجينات المثبطة والجينات القمعية الورم ، وذلك باستخدام متفاوت المسافات التنظيمية المتداخلة تقنيه تحرير الجينوم القائمة علي الجينات القصيرة (CRISPR) في الفئران. هذه التكنولوجيا تسمح لنا لمحاكاة بدقه التغيرات الجينية التي تحدث في السرطانات البشرية باستخدام الفئران. من خلال تحويل وراثيا الخلايا الاوليه murine ، يمكننا دراسة أفضل لتطوير السرطان ، والتقدم ، والعلاج ، والتشخيص. في هذه الدراسة ، استخدمنا Cre-المحرض كاس 9 اللسان الماوس الخلايا الظهاريه لتمكين الجينوم التحرير باستخدام الفيروسات المرتبطة adeno (AAV) في المختبر. علي وجه التحديد ، عن طريق تغيير KRAS ، p53 ، و APC في الخلايا الظهاريه اللسان العادية ، ونحن ولدت الراس والرقبة murine السرطان (HNC) خط الخلية في المختبر ، والذي هو توموريغينيك في الفئران المتزامنة. تصف الطريقة المعروضة هنا بالتفصيل كيفيه توليد الخطوط الخلوية HNC مع التعديلات الجينية محدده ويشرح ملاءمتها للتنبؤ تطور الورم في الفئران المتزامنة. ونحن نتصور ان هذه الطريقة الواعدة ستكون مفيده لدراسة البيولوجيا السرطانية والعلاج من HNC.
Introduction
HNC هو الخبيثة الشائعة في جميع انحاء العالم1. نمذجة نشاه الأورام HNC حاليا في نقطه تحول العلمية2. في حين تم التعرف علي العديد من الطفرات الجينية في hnc2،3،4 (مثل ، TP53 ، PIK3CA ، NOTCH1 ، FAT1 ، وراس) التوليفات محدده من التعديلات الجينية المطلوبة في الحفل للحث علي hnc تبقي غير واضحة.
وقد ساعد الاستخدام الحالي للخطوط الخلوية HNC البشرية بشكل كبير لتوضيح أليات المرتبطة بالتسبب والعلاج3. ومع ذلك ، فان دراسة خطوط الخلايا البشرية في أنظمه الجينات المناعية لها حدودها ، لان هذه الانظمه لا تعالج عمليه الأورام المجهرية ، ودور طفرات جينيه محدده ، واستجابات العلاج في بيئة ميكرومناعيه. التالي ، فان تطوير وإنشاء خطوط خلايا murine مع التعديلات الجينية المحددة هي ذات اهميه أساسيه لدراسة كيفيه مساهمه الجينات المختلفة في عمليه التحول واختبار العلاجات الجديدة القائمة علي جزيء في الفئران المناعية.
وقد تاثرت دراسات وظائف الجينات في البحوث الطبية الحيوية بشكل كبير بالتقدم في تكنولوجيات تحرير الحمض النووي ، من خلال إدخال فواصل مزدوجة الحبل (DSBs) ، علي سبيل المثال5. هذه التكنولوجيات ، بما في ذلك استخدام الزنك الاصبع السبابة ، النسخ المنشط مثل المنحرف المستجيب ، وتكرار الفاصلة التنظيمية متباعدة المتداخلة (CRISPR/كاس 9) ، تسمح للتلاعب من اي جين الفائدة في موضعها. وتتالف أحدث أنظمه CRISPR/كاس 9 من دليل RNA (gRNA) الذي يوجه النيوداز كاس 9 لتوليد DSB في موقع معين في الجينوم. وقد اكتسب هذا النظام اعترافا واسع النطاق في تعديل الجينات الذاتية في اي خليه أو الانسجه المستهدفة ، حتى في الكائنات الأكثر صعوبة لعلاج التقليدية5. لديها مزايا متعددة علي الانظمه الأخرى نظرا لبساطتها ، والسرعة ، والكفاءة.
في مجال الأورام ، حققت تقنيه CRISPR/كاس 9 الحاجة إلى تقليد الخلايا السرطانية بشكل فعال. لإنشاء هذا النظام في hnc ، ونحن التلاعب القوية kras ورمي واثنين من الجينات المثبطة الأورام الهامه ، APC و p536. وفقا لقاعده بيانات الجني7، وهذا المزيج هو نادر في hnc. الطفرات RAS (HRAS ، NRAS ، و KRAS) موجودة في فقط ~ 7 ٪ من جميع السكان HNC. هذه الأورام تميل إلى ان تكون مقاومه للعلاج8،9.
ويتحقق تسليم كاس 9 والgrna من خلال المحولات الفيروسية باستخدام الطائرات بالطائرة أو اللينتيفيروسيس. المؤتلف AAV غالبا ما يكون الأسلوب المفضل لتقديم الجينات إلى الخلايا المستهدفة نظرا لارتفاع titer ، استجابه مناعية خفيفه ، والقدرة علي نقل مجموعه واسعه من الخلايا ، والسلامة العامة. باستخدام نظام AAV ، تم إنشاء خطوط خلايا الماوس المختلفة الانسجه الخاصة ، وخطوط الخلايا الجديدة لا تزال قيد التطوير10،11،12. ومع ذلك ، فان نظام التحرير الجيني الفعال الذي يمكن ان يولد خلايا نماذج خطوط الخلية التي لا يزال يتعين تطويرها. في هذه الدراسة ، سعينا لتطوير نظام القائم علي كاس 9 في المختبر لتحويل خلايا اللسان الاوليه murine إلى حاله الأورام. ويمكن استخدام هذا البروتوكول فريدة من نوعها CRISPR/كاس 9 التحول وخط الخلايا السرطانية التي أنشئت لفهم أفضل بيولوجيا HNC الناجمة عن تنوع التغييرات الجينوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت عده طرق سابقا لتحويل الخلايا الاساسيه في الثقافة مع درجات متفاوتة من النجاح25,26,27,28. معظم هذه الطرق استخدام خلايا الخلية الليفية الماوس للتحول14،17،18،<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود ان نشكر الدكتور دانيال Gitler لتزويدنا مع pAd دلتا 5 المساعد plasmid. تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسه العلوم الاسرائيليه 700/16) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه العلوم الثنائية بين الولايات المتحدة وإسرائيل (بالنسبة لي ، 2017323) ، وجمعيه السرطان الاسرائيليه (ICA ، 20170024) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه أبحاث السرطان الاسرائيليه (ICRF ، 17-1693-ركدا) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه #7895 الزمالة: زمالة ألون لي وزمالات BGU Kreitman إلى SJ و MP.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O’Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
