مطلوب تطوير نماذج murine مع جينات محدده تحور في مرضي سرطان الراس والرقبة لفهم الأورام. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول للتحول في المختبر من خلايا اللسان الاوليه murine باستخدام نظام الفيروسات المرتبطة adeno-كاس 9 لتوليد murine الخلايا HNC خطوط مع التعديلات الجينية محدده.
استخدام الخلايا الظهاريه العادية الاوليه يجعل من الممكن التكرار الحث علي التغييرات الجينية اللازمة للتحول الخلوي من خلال إدخال طفرات محدده في الجينات المثبطة والجينات القمعية الورم ، وذلك باستخدام متفاوت المسافات التنظيمية المتداخلة تقنيه تحرير الجينوم القائمة علي الجينات القصيرة (CRISPR) في الفئران. هذه التكنولوجيا تسمح لنا لمحاكاة بدقه التغيرات الجينية التي تحدث في السرطانات البشرية باستخدام الفئران. من خلال تحويل وراثيا الخلايا الاوليه murine ، يمكننا دراسة أفضل لتطوير السرطان ، والتقدم ، والعلاج ، والتشخيص. في هذه الدراسة ، استخدمنا Cre-المحرض كاس 9 اللسان الماوس الخلايا الظهاريه لتمكين الجينوم التحرير باستخدام الفيروسات المرتبطة adeno (AAV) في المختبر. علي وجه التحديد ، عن طريق تغيير KRAS ، p53 ، و APC في الخلايا الظهاريه اللسان العادية ، ونحن ولدت الراس والرقبة murine السرطان (HNC) خط الخلية في المختبر ، والذي هو توموريغينيك في الفئران المتزامنة. تصف الطريقة المعروضة هنا بالتفصيل كيفيه توليد الخطوط الخلوية HNC مع التعديلات الجينية محدده ويشرح ملاءمتها للتنبؤ تطور الورم في الفئران المتزامنة. ونحن نتصور ان هذه الطريقة الواعدة ستكون مفيده لدراسة البيولوجيا السرطانية والعلاج من HNC.
HNC هو الخبيثة الشائعة في جميع انحاء العالم1. نمذجة نشاه الأورام HNC حاليا في نقطه تحول العلمية2. في حين تم التعرف علي العديد من الطفرات الجينية في hnc2،3،4 (مثل ، TP53 ، PIK3CA ، NOTCH1 ، FAT1 ، وراس) التوليفات محدده من التعديلات الجينية المطلوبة في الحفل للحث علي hnc تبقي غير واضحة.
وقد ساعد الاستخدام الحالي للخطوط الخلوية HNC البشرية بشكل كبير لتوضيح أليات المرتبطة بالتسبب والعلاج3. ومع ذلك ، فان دراسة خطوط الخلايا البشرية في أنظمه الجينات المناعية لها حدودها ، لان هذه الانظمه لا تعالج عمليه الأورام المجهرية ، ودور طفرات جينيه محدده ، واستجابات العلاج في بيئة ميكرومناعيه. التالي ، فان تطوير وإنشاء خطوط خلايا murine مع التعديلات الجينية المحددة هي ذات اهميه أساسيه لدراسة كيفيه مساهمه الجينات المختلفة في عمليه التحول واختبار العلاجات الجديدة القائمة علي جزيء في الفئران المناعية.
وقد تاثرت دراسات وظائف الجينات في البحوث الطبية الحيوية بشكل كبير بالتقدم في تكنولوجيات تحرير الحمض النووي ، من خلال إدخال فواصل مزدوجة الحبل (DSBs) ، علي سبيل المثال5. هذه التكنولوجيات ، بما في ذلك استخدام الزنك الاصبع السبابة ، النسخ المنشط مثل المنحرف المستجيب ، وتكرار الفاصلة التنظيمية متباعدة المتداخلة (CRISPR/كاس 9) ، تسمح للتلاعب من اي جين الفائدة في موضعها. وتتالف أحدث أنظمه CRISPR/كاس 9 من دليل RNA (gRNA) الذي يوجه النيوداز كاس 9 لتوليد DSB في موقع معين في الجينوم. وقد اكتسب هذا النظام اعترافا واسع النطاق في تعديل الجينات الذاتية في اي خليه أو الانسجه المستهدفة ، حتى في الكائنات الأكثر صعوبة لعلاج التقليدية5. لديها مزايا متعددة علي الانظمه الأخرى نظرا لبساطتها ، والسرعة ، والكفاءة.
في مجال الأورام ، حققت تقنيه CRISPR/كاس 9 الحاجة إلى تقليد الخلايا السرطانية بشكل فعال. لإنشاء هذا النظام في hnc ، ونحن التلاعب القوية kras ورمي واثنين من الجينات المثبطة الأورام الهامه ، APC و p536. وفقا لقاعده بيانات الجني7، وهذا المزيج هو نادر في hnc. الطفرات RAS (HRAS ، NRAS ، و KRAS) موجودة في فقط ~ 7 ٪ من جميع السكان HNC. هذه الأورام تميل إلى ان تكون مقاومه للعلاج8،9.
ويتحقق تسليم كاس 9 والgrna من خلال المحولات الفيروسية باستخدام الطائرات بالطائرة أو اللينتيفيروسيس. المؤتلف AAV غالبا ما يكون الأسلوب المفضل لتقديم الجينات إلى الخلايا المستهدفة نظرا لارتفاع titer ، استجابه مناعية خفيفه ، والقدرة علي نقل مجموعه واسعه من الخلايا ، والسلامة العامة. باستخدام نظام AAV ، تم إنشاء خطوط خلايا الماوس المختلفة الانسجه الخاصة ، وخطوط الخلايا الجديدة لا تزال قيد التطوير10،11،12. ومع ذلك ، فان نظام التحرير الجيني الفعال الذي يمكن ان يولد خلايا نماذج خطوط الخلية التي لا يزال يتعين تطويرها. في هذه الدراسة ، سعينا لتطوير نظام القائم علي كاس 9 في المختبر لتحويل خلايا اللسان الاوليه murine إلى حاله الأورام. ويمكن استخدام هذا البروتوكول فريدة من نوعها CRISPR/كاس 9 التحول وخط الخلايا السرطانية التي أنشئت لفهم أفضل بيولوجيا HNC الناجمة عن تنوع التغييرات الجينوم.
وقد استخدمت عده طرق سابقا لتحويل الخلايا الاساسيه في الثقافة مع درجات متفاوتة من النجاح25,26,27,28. معظم هذه الطرق استخدام خلايا الخلية الليفية الماوس للتحول14،17،18،<…
The authors have nothing to disclose.
نود ان نشكر الدكتور دانيال Gitler لتزويدنا مع pAd دلتا 5 المساعد plasmid. تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسه العلوم الاسرائيليه 700/16) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه العلوم الثنائية بين الولايات المتحدة وإسرائيل (بالنسبة لي ، 2017323) ، وجمعيه السرطان الاسرائيليه (ICA ، 20170024) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه أبحاث السرطان الاسرائيليه (ICRF ، 17-1693-ركدا) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه #7895 الزمالة: زمالة ألون لي وزمالات BGU Kreitman إلى SJ و MP.
Antibodies | |||
Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
Cre | BioLegend | 900901 | |
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
Cell lines | |||
HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
HBSS | Sigma | H6648 | |
Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
PEI | Polysciences | 23966-1 | |
Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
Enzymes | |||
Benzonase | Sigma | E1014 | |
Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
Glass wares | |||
Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
Slides | Bar Naor | BN9308C | |
Mouse strains | |||
C57BL/6 | Envigo | ||
B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
Plasmids | |||
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
Plastic wares | |||
Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
Culture plates | Greiner Bio-One | ||
Falcon tubes | Greiner Bio-One |