In vitro inrättande av en genetiskt modifierad murin huvud och hals cancer cellinjer med ett Adeno-associerat virus-Cas9 system
Summary
Utveckling av murina modeller med specifika gener muterade i huvud-och halscancer patienter krävs för förståelsen av neoplasi. Här presenterar vi ett protokoll för in vitro-omvandling av primära murina tungan celler med ett Adeno-associerat virus-Cas9 system för att generera murina HNC cellinjer med specifika genomiska förändringar.
Abstract
Användning av primära normala epitelceller gör det möjligt att reproducerbart inducera genomiska förändringar som krävs för cellulär omvandling genom att införa specifika mutationer i onkogener och tumörsuppressorgener, med hjälp av klustrade regulatoriska interfördelade kort palindrom REPEAT (CRISPR)-baserad genredigeringsteknik hos möss. Denna teknik ger oss möjlighet att exakt efterlikna de genetiska förändringar som sker i mänskliga cancerformer med hjälp av möss. Genom att genetiskt omvandla murina primära celler, vi kan bättre studera cancerutveckling, progression, behandling, och diagnos. I denna studie, vi använde CRE-inducerbara Cas9 mus tungan epitelceller att möjliggöra genom redigering med Adeno-Associated virus (AAV) in vitro-. Specifikt, genom att förändra Kras, p53, och APC i normala tungan epitelceller, genererade vi en murin huvud och halscancer (HNC) cellinjer in vitro, som är tumörframkallande i uterustransplantat möss. Den metod som presenteras här beskriver i detalj hur man genererar HNC cellinjer med specifika genomiska förändringar och förklarar deras lämplighet för att förutsäga tumör progression i uterustransplantat möss. Vi föreställa sig att denna lovande metod kommer att vara informativ och användbar för att studera tumörbiologi och terapi av HNC.
Introduction
HNC är en vanlig malignitet över hela världen1. Modellering uppkomsten av HNC neoplasi är för närvarande vid en vetenskaplig vändpunkt2. Medan många genetiska mutationer har identifierats i HNC2,3,4 (t. ex. TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1, och RAS) de specifika kombinationer av genomiska förändringar som krävs i samförstånd för att inducera HNC förbli oklara.
Den nuvarande användningen av mänskliga HNC cellinjer har signifikant bidragit till att belysa mekanismerna i samband med patogenes och behandling3. Emellertid, studiet av mänskliga cellinjer i immunkomprometterade murina system har sina begränsningar, eftersom dessa system inte ta itu med in vivo neoplastiska processen, den roll som specifika genmutationer, och behandlingssvar i en immun mikromiljö. Därför är utveckling och etablering av murina cellinjer med specifika genetiska förändringar av största vikt för att studera hur olika gener bidrar till omvandlingsprocessen och för att testa nya molekyl-baserade terapier hos immunkompetenta möss.
Gen funktionsstudier inom biomedicinsk forskning har påverkats betydligt av framstegen inom DNA-redigeringstekniker, genom att införa dubbel-strand raster (DSBs), till exempel5. Dessa tekniker, inklusive användning av zink finger nukleaser, transkription Activator-liknande effektornukleaser, och klustrade regulatoriska interfördelade korta palindrom repetitioner (CRISPR/Cas9), möjliggöra manipulation av någon gen av intresse vid dess Locus. Den senaste CRISPR/Cas9 system består av en guide RNA (gRNA) som leder Cas9 Nuclease att generera en DSB på en specifik plats i genomet. Detta system har fått ett omfattande erkännande i att modifiera endogena gener i någon cell eller målvävnad, även i de mest traditionellt svårbehandlade organismerna5. Det har flera fördelar jämfört med andra system på grund av dess enkelhet, snabbhet och effektivitet.
I onkologi har CRISPR/CAS9 Technology uppfyllt behovet av att effektivt efterlikna cancerceller. För att etablera detta system i HNC, manipulerade vi potenta KRAS onkogen och två viktiga tumörsuppressorgener, APC och p536. Enligt GENIE databas7, denna kombination är sällsynt i HNC. RAS-mutationer (HRAS, NRAS och KRAS) förekommer i endast ~ 7% av alla HNC populationer. Dessa tumörer tenderar att vara resistenta mot terapi8,9.
Leverans av Cas9 och dess gRNA uppnås genom viral transduktion med antingen AAVs eller lentiviruses. Rekombinant AAV är ofta den föredragna metoden för att leverera gener till målceller på grund av dess höga titer, milt immunsvar, förmåga att transduce ett brett spektrum av celler, och övergripande säkerhet. Med hjälp av ett AAV-system har olika vävnadsspecifika mus cells linjer genererats, och nya cellinjer utvecklas fortfarande10,11,12. Men en effektiv genomisk redigering system som kan generera murina HNC cell linje modeller celler återstår att utvecklas. I denna studie, vi försökte utveckla en in vitro AAV-Cas9-baserade system för att omvandla primära murina tungan celler till en tumörframkallande tillstånd. Detta unika CRISPR/Cas9 Transformation Protocol och den etablerade tumör cellinjer kan användas för att bättre förstå biologi av HNC induceras av en mångfald av genomiska förändringar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera metoder har tidigare använts för att omvandla primära celler i kulturen med varierande grad av framgång25,26,27,28. De flesta av dessa metoder använder mus fibroblast celler för omvandling14,17,18,19 eller använda cancerframkallande ämnen såsom 4-nitrok…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka doktor Daniel Gitler för att förse oss med pAd delta 5 Helper plasmid. Detta arbete finansierades av Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (för mig), USA-Israel binational Science Foundation (BSF, 2017323) (för mig och MS), The Israel cancer Association (ICA, 20170024) (för mig), Israel cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (för mig), och oro Foundation (#7895) (för mig). Fellowship: Alon Fellowship till mig och BGU kreitman stipendier till SJ och MP.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O’Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
