Utveckling av murina modeller med specifika gener muterade i huvud-och halscancer patienter krävs för förståelsen av neoplasi. Här presenterar vi ett protokoll för in vitro-omvandling av primära murina tungan celler med ett Adeno-associerat virus-Cas9 system för att generera murina HNC cellinjer med specifika genomiska förändringar.
Användning av primära normala epitelceller gör det möjligt att reproducerbart inducera genomiska förändringar som krävs för cellulär omvandling genom att införa specifika mutationer i onkogener och tumörsuppressorgener, med hjälp av klustrade regulatoriska interfördelade kort palindrom REPEAT (CRISPR)-baserad genredigeringsteknik hos möss. Denna teknik ger oss möjlighet att exakt efterlikna de genetiska förändringar som sker i mänskliga cancerformer med hjälp av möss. Genom att genetiskt omvandla murina primära celler, vi kan bättre studera cancerutveckling, progression, behandling, och diagnos. I denna studie, vi använde CRE-inducerbara Cas9 mus tungan epitelceller att möjliggöra genom redigering med Adeno-Associated virus (AAV) in vitro-. Specifikt, genom att förändra Kras, p53, och APC i normala tungan epitelceller, genererade vi en murin huvud och halscancer (HNC) cellinjer in vitro, som är tumörframkallande i uterustransplantat möss. Den metod som presenteras här beskriver i detalj hur man genererar HNC cellinjer med specifika genomiska förändringar och förklarar deras lämplighet för att förutsäga tumör progression i uterustransplantat möss. Vi föreställa sig att denna lovande metod kommer att vara informativ och användbar för att studera tumörbiologi och terapi av HNC.
HNC är en vanlig malignitet över hela världen1. Modellering uppkomsten av HNC neoplasi är för närvarande vid en vetenskaplig vändpunkt2. Medan många genetiska mutationer har identifierats i HNC2,3,4 (t. ex. TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1, och RAS) de specifika kombinationer av genomiska förändringar som krävs i samförstånd för att inducera HNC förbli oklara.
Den nuvarande användningen av mänskliga HNC cellinjer har signifikant bidragit till att belysa mekanismerna i samband med patogenes och behandling3. Emellertid, studiet av mänskliga cellinjer i immunkomprometterade murina system har sina begränsningar, eftersom dessa system inte ta itu med in vivo neoplastiska processen, den roll som specifika genmutationer, och behandlingssvar i en immun mikromiljö. Därför är utveckling och etablering av murina cellinjer med specifika genetiska förändringar av största vikt för att studera hur olika gener bidrar till omvandlingsprocessen och för att testa nya molekyl-baserade terapier hos immunkompetenta möss.
Gen funktionsstudier inom biomedicinsk forskning har påverkats betydligt av framstegen inom DNA-redigeringstekniker, genom att införa dubbel-strand raster (DSBs), till exempel5. Dessa tekniker, inklusive användning av zink finger nukleaser, transkription Activator-liknande effektornukleaser, och klustrade regulatoriska interfördelade korta palindrom repetitioner (CRISPR/Cas9), möjliggöra manipulation av någon gen av intresse vid dess Locus. Den senaste CRISPR/Cas9 system består av en guide RNA (gRNA) som leder Cas9 Nuclease att generera en DSB på en specifik plats i genomet. Detta system har fått ett omfattande erkännande i att modifiera endogena gener i någon cell eller målvävnad, även i de mest traditionellt svårbehandlade organismerna5. Det har flera fördelar jämfört med andra system på grund av dess enkelhet, snabbhet och effektivitet.
I onkologi har CRISPR/CAS9 Technology uppfyllt behovet av att effektivt efterlikna cancerceller. För att etablera detta system i HNC, manipulerade vi potenta KRAS onkogen och två viktiga tumörsuppressorgener, APC och p536. Enligt GENIE databas7, denna kombination är sällsynt i HNC. RAS-mutationer (HRAS, NRAS och KRAS) förekommer i endast ~ 7% av alla HNC populationer. Dessa tumörer tenderar att vara resistenta mot terapi8,9.
Leverans av Cas9 och dess gRNA uppnås genom viral transduktion med antingen AAVs eller lentiviruses. Rekombinant AAV är ofta den föredragna metoden för att leverera gener till målceller på grund av dess höga titer, milt immunsvar, förmåga att transduce ett brett spektrum av celler, och övergripande säkerhet. Med hjälp av ett AAV-system har olika vävnadsspecifika mus cells linjer genererats, och nya cellinjer utvecklas fortfarande10,11,12. Men en effektiv genomisk redigering system som kan generera murina HNC cell linje modeller celler återstår att utvecklas. I denna studie, vi försökte utveckla en in vitro AAV-Cas9-baserade system för att omvandla primära murina tungan celler till en tumörframkallande tillstånd. Detta unika CRISPR/Cas9 Transformation Protocol och den etablerade tumör cellinjer kan användas för att bättre förstå biologi av HNC induceras av en mångfald av genomiska förändringar.
Flera metoder har tidigare använts för att omvandla primära celler i kulturen med varierande grad av framgång25,26,27,28. De flesta av dessa metoder använder mus fibroblast celler för omvandling14,17,18,19 eller använda cancerframkallande ämnen såsom 4-nitrok…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka doktor Daniel Gitler för att förse oss med pAd delta 5 Helper plasmid. Detta arbete finansierades av Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (för mig), USA-Israel binational Science Foundation (BSF, 2017323) (för mig och MS), The Israel cancer Association (ICA, 20170024) (för mig), Israel cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (för mig), och oro Foundation (#7895) (för mig). Fellowship: Alon Fellowship till mig och BGU kreitman stipendier till SJ och MP.
Antibodies | |||
Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
Cre | BioLegend | 900901 | |
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
Cell lines | |||
HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
HBSS | Sigma | H6648 | |
Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
PEI | Polysciences | 23966-1 | |
Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
Enzymes | |||
Benzonase | Sigma | E1014 | |
Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
Glass wares | |||
Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
Slides | Bar Naor | BN9308C | |
Mouse strains | |||
C57BL/6 | Envigo | ||
B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
Plasmids | |||
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
Plastic wares | |||
Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
Culture plates | Greiner Bio-One | ||
Falcon tubes | Greiner Bio-One |