Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration
Summary
Kollektive Zellmigration in Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung wird oft von den Gradienten von Wachstumsfaktoren oder Signalmolekülen geleitet. Hier wird ein experimentelles System beschrieben, das Traktionsmikroskopie mit einem mikrofluidischen System kombiniert und demonstriert, wie die Mechanik der kollektiven Migration unter biochemischen Gradienten quantifiziert werden kann.
Abstract
Zellen verändern Migrationsmuster als Reaktion auf chemische Reize, einschließlich der Gradienten der Reize. Die zelluläre Migration in Richtung eines chemischen Gradienten, bekannt als Chemotaxis, spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung, der Immunantwort, der Wundheilung und der Krebsmetastasierung. Während Chemotaxis die Migration einzelner Zellen sowie der Sammlungen von Zellen in vivo modulieren, konzentriert sich die In-vitro-Forschung auf einzellige Chemotaxis, teilweise aufgrund des Fehlens der richtigen experimentellen Werkzeuge. Um diese Lücke zu schließen, wird hier ein einzigartiges experimentelles System beschrieben, das Mikrofluidik und Mikromuster kombiniert, um die Auswirkungen chemischer Gradienten auf die kollektive Zellmigration zu demonstrieren. Darüber hinaus werden Traktionsmikroskopie und Monolayer-Stressmikroskopie in das System integriert, um Veränderungen der Zellkraft auf dem Substrat sowie zwischen benachbarten Zellen zu charakterisieren. Als Proof-of-Concept wird die Migration von mikrogemusterten kreisförmigen Inseln von Madin-Darby-Canine-Kidney-Zellen (MDCK) unter einem Gradienten des Hepatozytenwachstumsfaktors (HGF), einem bekannten Streufaktor, getestet. Es wird festgestellt, dass Zellen, die sich in der Nähe der höheren Konzentration von HGF befinden, schneller migrieren als zellennahe Zellen auf der gegenüberliegenden Seite innerhalb einer Zellinsel. Innerhalb der gleichen Insel ist die zelluläre Traktion auf beiden Seiten ähnlich, aber die interzelluläre Belastung ist auf der Seite einer höheren HGF-Konzentration viel geringer. Dieses neuartige experimentelle System kann neue Möglichkeiten bieten, die Mechanik der chemotaktischen Migration durch zelluläre Kollektive zu untersuchen.
Introduction
Die zelluläre Migration in biologischen Systemen ist ein grundlegendes Phänomen, das an der Gewebebildung, der Immunantwort und der Wundheilung beteiligt ist1,2,3. Zelluläre Migration ist auch ein wichtiger Prozess bei einigen Krankheiten wie Krebs4. Zellen werden oft als Gruppe und nicht als Einzeln migriert, was als kollektive Zellmigration4,5bezeichnet wird. Damit sich Zellen kollektiv bewegen können, ist die Erfassung der Mikroumgebung unerlässlich6. Zum Beispiel nehmen Zellen physikalisch-chemische Reize wahr und reagieren durch Veränderung der Beweglichkeit, Zell-Substrat-Wechselwirkungen und Zell-Zell-Wechselwirkungen, was zu einer Richtungsmigration entlang eines chemischen Gradienten7,8, 9,10. Basierend auf dieser Verbindung wurden schnelle Fortschritte in Lab-on-a-Chip-Technologien gemacht, die gut kontrollierte chemische Mikroumgebungen wie den Gradienten eines Chemoattractanten11,12,13 erzeugen können. . Während diese Lab-on-a-Chip-basierte Mikrofluidik bisher verwendet wurden, um Chemotaxis des Zellensembles oder zelluläre Sphäroide14,15,16,17zu studieren, wurden hauptsächlich im Zusammenhang mit der Einzelzellmigration18,19,20,21verwendet. Mechanismen, die einer zellulären kollektiven Reaktion auf einen chemischen Gradienten zugrunde liegen, sind immer noch nicht gut verstanden14,22,23,24,25,26 . So wird die Entwicklung einer Plattform, die die raumzeitliche Kontrolle von löslichen Faktoren sowie die in-situ-Beobachtung der biophysikalischen Zellen ermöglicht, dazu beitragen, die Mechanismen hinter der kollektiven Zellmigration zu entwirren.
Entwickelt und beschrieben ist hier ein mehrkanaliges mikrofluidisches System, das die Erzeugung eines Konzentrationsgradienten von löslichen Faktoren ermöglicht, der die Migration von gemusterten Zellclustern moduliert. In dieser Studie, Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) wird gewählt, um das Migrationsverhalten von Madin-Darby Canine Nieren (MDCK) Zellen zu regulieren. HGF ist dafür bekannt, die Zell-Zell-Integrität zu dämpfen und die Beweglichkeit der Zellen27,28zu verbessern. Im mikrofluidischen System sind fourier transform traktionsmikroskopie und Monolayer-Stressmikroskopie integriert, die eine Analyse der Beweglichkeit, Kontraktilenkraft und interzellulären Spannung ermöglicht, die von konstituierenden Zellen als Reaktion auf ein HGF induziert werden. gefälle. Innerhalb derselben Insel wandern Zellen, die sich in der Nähe der höheren Konzentration von HGF befinden, schneller und weisen niedrigere interzelluläre Belastungen auf als zellenübergreifende Belastungen als zellennahe Mit geringerer HGF-Konzentration. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses neue experimentelle System geeignet ist, andere Fragen in Bereichen zu untersuchen, die eine kollektive zelluläre Migration unter chemischen Gradienten verschiedener löslicher Faktoren beinhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die kollektive Migration von Zellbestandteilen ist ein wichtiger Prozess während der Entwicklung und Regeneration, und die Migrationsrichtung wird oft durch den chemischen Gradienten der Wachstumsfaktoren4,23geleitet. Während der kollektiven Migration interagieren Zellen weiterhin mit benachbarten Zellen und zugrunde liegenden Substraten. Solche mechanischen Wechselwirkungen führen zu auftauchenden Phänomenen wie Durotaxis42, plithotax…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das von der koreanischen Regierung (MSIP) (Nr. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant und das BK 21 Plus Programm. Es wurde auch von den National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696) unterstützt.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
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