מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק
Summary
הגירה תא קולקטיבי בפיתוח, ריפוי הפצע, וגרורות סרטן מונחה לעתים קרובות על ידי מעברי הצבע של גורמי גדילה או מולקולות איתות. המתואר כאן היא מערכת ניסיונית המשלבת מיקרוסקופ המתיחה עם מערכת microflu, והפגנה של איך לכמת את המכניקה של הגירה קולקטיבית תחת הדרגתי הביוכימי.
Abstract
תאים משנים דפוסי הגירה בתגובה לגירויים כימיים, כולל מעברי הצבע של הגירויים. הגירה סלולרית בכיוון של מעבר הדרגתי כימי, המכונה כימוטקאס, ממלא תפקיד חשוב בפיתוח, התגובה החיסונית, הפצע ריפוי, וגרורות סרטן. בעוד כימוטקסיס מודולים את הגירה של תאים בודדים, כמו גם אוספים של תאים בvivo, במחקר מתורבת מתמקד כימווניות תא יחיד, בחלקו בשל העדר הכלים הניסיוניים הנכונה. כדי למלא את הפער, המתואר כאן הוא מערכת ניסיונית ייחודית המשלבת מיקרופלואידיקה ו מיקרופלנינג כדי להדגים את ההשפעות של מעברי כימיים על הגירה תא קולקטיבי. יתר על כן, מיקרוסקופ המתיחה ומיקרוסקופ הלחץ דופלקס משולבים במערכת כדי לאפיין שינויים בכוח הסלולר על מצע, כמו גם בין תאים שכנים. כהוכחה-of-קונספט, הגירה של האיים העגולים של מיקרותבנית של דין-דארבי כליות הכלב (MDCK) התאים נבדק תחת הדרגתי של גורם הצמיחה hepatocyte (HGF), גורם פיזור ידוע. הוא נמצא כי תאים הממוקמים בקרבת ריכוז גבוה יותר של HGF להגר מהר יותר מאשר אלה בצד הנגדי בתוך האי תא. בתוך אותו האי, המתיחה הסלולר דומה משני הצדדים, אבל הלחץ הבינתאי הוא הרבה יותר נמוך בצד של ריכוז HGF גבוה. מערכת זו הניסיונית הרומן יכול לספק הזדמנויות חדשות ללמוד את המכניקה של הגירה כימוטקטיק ידי הקולקטיבים הסלולריים.
Introduction
הגירה סלולרית במערכות ביולוגיות היא תופעה יסודית הכרוכה בהיווצרות רקמות, התגובה החיסונית, וריפוי הפצע1,2,3. הגירה סלולרית הוא גם תהליך חשוב בכמה מחלות כמו סרטן4. תאים לעיתים קרובות עוברים כקבוצה במקום בנפרד, המכונה העברת תאים קולקטיבית4,5. כדי שתאים יזוזו באופן קולקטיבי, חישת המיקרו-סביבה תהיה חיונית ב-6. למשל, תאים תופסים גירויים פיזיקליים ומגיבים על ידי שינוי תנועתיות, אינטראקציות תאים ואינטראקציות תאים, והתוצאה היא הגירה כיוונית לאורך מעבר צבע כימי7,8, 9,10. בהתבסס על הקשר הזה, נעשו התקדמויות מהירות בטכנולוגיות מעבדה על שבב שיכולות ליצור מיקרוסביבות כימיות מבוקרות היטב כגון הדרגתי של כימוסטנט11,12,13 . בעוד המעבדה-on-a-שבב מבוססי מיקרופלואידיקה שימשו בעבר כדי ללמוד כימוטקוניות של האנסמבל הסלולר או spheroids הסלולר14,15,16,17, הם היו בשימוש בעיקר בהקשר של הגירה תא יחיד18,19,20,21. מנגנונים הנמצאים בבסיס תגובה קולקטיבית הסלולר למעבר מעבר כימי עדיין לא מובנים היטב14,22,23,24,25,26 . לפיכך, פיתוח פלטפורמה המאפשרת השליטה הרקתית הטמפורלית של גורמים מסיסים, כמו גם התבוננות באתרו של תאים ‘ ביופיזיקלי יסייע לפענח את המנגנונים מאחורי הגירה תא קולקטיבי.
פיתח ותיאר כאן הוא מערכת מיקרופלואידיג multi-מנותבת המאפשרת את הדור של הדרגתי ריכוז של גורמים מסיסים, כי הגירה מודולים של אשכולות תאים בדוגמת. במחקר זה, מקדם צמיחה hepatocyte (HGF) נבחרה כדי לווסת את התנהגות הנדידה של דין-דארבי כליה כליות (MDCK) תאים. Hgf ידוע להחליש את התאים התא התא ולשפר את תנועתיות התאים27,28. במערכת המיקרופלואידיג, מיקרוסקופ המתיחה של פורייה ומיקרוסקופ מונאולייר משולבים גם הם, המאפשר ניתוח של התנועתיות, כוח כריתת הגוף, והמתח הבינתאי הנגרם על ידי התאים המרכיבים בתגובה ל HGF עבר צבע. בתוך האי זהה, תאים הממוקמים בקרבת ריכוז גבוה יותר של hgf להעביר מהר יותר ולהראות נמוך יותר התרבות רמות הלחץ מאשר אלה בצד עם ריכוז hgf נמוך. התוצאות מרמזות על כך שהמערכת הניסיונית החדשה הזאת מתאימה לחקור שאלות אחרות בתחומים הכרוכים בהעברה סלולרית קולקטיבית תחת מעברי מדרגות כימיים של גורמים מסיסים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגירה קולקטיבית של תאים בוחרים הוא תהליך חשוב במהלך פיתוח והתחדשות, וכיוון הנדידה מודרך לעתים קרובות על ידי הדרגה הכימית של גורמי גדילה4,23. במהלך הגירה קולקטיבית, התאים ממשיכים לקיים אינטראקציה עם תאים שכנים ומצעים המשמשים כבסיס. אינטראקציות מכניות כאלה מע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) המענק ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (לא. NRF-2017R1A1A01075103), מענק אוניברסיטת קוריאה, ותוכנית BK 21 פלוס. זה היה גם נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
References
- Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
- Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
- Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
- Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
- Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
- Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
- Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
- McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
- Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
- Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
- Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
- McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
- Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
- Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
- Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
- Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 041918 (2010).
- Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
- Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
- Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
- Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
- Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
- Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).
