ケネラブディティス・エレガンスの腸透過性に及ぼす細菌および化学物質の影響の測定
Summary
このプロトコルは、カエネラブディティスエレガンスの腸透過性を測定する方法を記述します。この方法は、腸内細菌とその宿主との相互作用に関連する腸の健康に関する基礎生物学的研究や、漏出性腸症候群および炎症性腸疾患を治癒するためのプロバイオティクスおよび化学薬品を同定するためのスクリーニングに役立ちます。
Abstract
生体では、腸の透過性が多くの炎症性腸疾患(IBD)につながる深刻な症状です。カエノラブディティス・エレガンスは、寿命が短く、透明性、費用対効果、動物倫理の問題がないため、アッセイシステムとして広く使用されている非哺乳動物モデルです。本研究では、高スループット画像解析システムを用いたC.エレガンスの腸透過性に対する異なる細菌および3,3′-ジインドリルメタン(DIM)の影響を調べる方法を開発した。ワームは異なる腸内細菌に感染するか、DIMで48時間治療し、一晩フッ素セインイソチオシアネート(FITC)-デキストランを供給した。次いで、虫体内部の蛍光画像と蛍光強度を比較して腸透過性を調べた。この方法はまた、動物モデルの腸透過性に影響を与えるプロバイオティクスおよび病原性腸細菌を同定する可能性があり、腸の透過性および腸の健康に有害または健康増進化学物質の影響を調べるのに有効である。しかし、このプロトコルはまた、この方法は主にフェトチピック決定に使用されるため、特に病気を制御するために変更される遺伝子を決定するために、遺伝的レベルでいくつかのかなりの制限を有する。さらに、この方法は、どの病原性基質が炎症を引き起こすか、感染中にワームの腸の透過性を高めるかを正確に決定することに限定される。そこで、変異型細菌や線虫を用いた分子遺伝機構の調査や細菌の化学成分分析など、さらに詳細な研究が必要であり、腸透過性を決定する上で細菌や化学物質の機能を十分に評価することが求められている。
Introduction
腸透過性は、腸内微生物叢および粘膜免疫に関連する主要な障壁の1つと考えられており、腸内微生物叢修飾、上皮障害、または粘液層変化1などのいくつかの要因によって影響を受ける可能性がある。最近の論文では、腸細胞層2全体の蛍光フラックス率を分析して培養したヒト腸細胞の腸透過性を測定する有効なプロトコルが報告されているが、FITC-dextran染色を用いて、特にC.エレガンスにおいて線虫の腸透過率を測定するのに適した手順を提示する研究論文は少ない。
ナイル赤3とエリオグラウシン二ナトリウム(またはスマーフアッセイ)4、5を用いてC.エレガンスにおける腸透過性を測定するための代表的なプロトコルが2つあります。このプロトコルでは、ナイル赤(MW = 318.37)およびエリオグラウシン二ナトリウム(MW = 792.85)よりもはるかに高い分子量を有するFITC-dextran(平均分子量10,000)を使用しました。FITC-デキストランは、ナイル赤やエリオグラシン二ナトリウム染料よりも、腸層を通して吸収される炭水化物などの実際の高分子栄養素に似ています。エリオグラウシン二ナトリウム(青スマーフ色素)を供給するC.エレガンスの腸透過性は、蛍光顕微鏡なしで容易に評価することができる。しかしながら、スマーフアッセイでは、標準化の欠如により腸透過性の定量分析が困難であり、手動で評価されるべきである4、5。ナイル赤アッセイの場合、ナイル赤色はまた、細胞内の脂質液滴を染色し、C.エレガンス6における腸透過性の正確な決定を妨げる可能性がある。本プロトコルは、非特異的脂質染色を回避しながら、様々な腸内細菌および化学物質で処理されたC.エレガンスにおける腸透過性の迅速かつ正確な定量分析を可能にする。
C.エレガンスは、その手頃な価格、簡単な操作、限られた動物倫理の問題、および迅速な実験7のために有益である短寿命のために生物学的分野の典型的なモデルです。特に、C.エレガンスゲノム全体が公表された後、C.エレガンスゲノム中の遺伝子の40%近くがヒト疾患を引き起こす遺伝子に対して正交的であることが判明した8.さらに、透明体は、細胞イベントの研究や細胞生物学における蛍光用途、例えばDAPIまたは免疫組織化学9による幹細胞染色に有利である生物内部の観察を可能にする。C.エレガンスは、腸内微生物叢と宿主との相互作用を研究するための実験動物としてしばしば使用される。加えて、C.エレガnsは、腸の健康を促進する食物化学物質10、11、12ならびに腸の健康を促進する食事化学物質をスクリーニングするために使用される。
緑膿菌および腸球菌は、消化管系に悪影響を及ぼすよく知られた腸内細菌であり、特に腸管15、16の大腸上皮細胞である。したがって、これらの細菌によって引き起こされる腸透過性を測定することは、細菌の炎症や感染によって引き起こされる損傷を回復し、軽減することができる新薬のスクリーニングおよび開発のために必要である。このプロトコルでは、これらの腸内細菌がC.エレガンスの腸透過性に及ぼす影響を試験した。
我々はまた、C.エレガンスの腸透過性に関する化学物質をテストするための最適化されたプロトコルを報告する。この目的のために、DIMはブラッシカ食品植物に存在するインドール-3-カルビノール由来の生理活性代謝産物化合物であり、マウス17、18におけるIBDに対する治療効果を有することが報告されているため、モデル化学薬品として3,3′-ジインドリルメタン(DIM)を使用した。また、最近、DIMが培養したヒト腸細胞およびモデル線虫C.エレガンス19の両方において腸透過性機能障害を改善することを発見した。
本研究では、3つの異なる実験条件を用いった。まず、異なる細菌、P.エルギノーサおよびE.フェカリスが腸透過性に及ぼす影響を測定した(図1)。次に、生きた熱不活性化P.エルギノーサが腸透過性に及ぼす影響を測定した(図2)。第3に、P.エルギノーサを与えたC.エレガンスの腸透過性に対するDIM(モデル化学物質)の影響を測定した(図3)。
本研究の目的は、様々な腸内細菌や化学物質による治療によって変化するC.エレガンスの腸透過性を測定する最適化されたプロトコルを開発することであった。
Protocol
Representative Results
Discussion
自動化された蛍光顕微鏡と定量画像分析を組み合わせたC.エレガンスにおける腸透過性を決定するこの新しい方法を利用することにより、腸内微生物または化学物質によって引き起こされる差異を、特にC.エレガンス腸で生体内で決定することができます。このプロトコルは、腸の透過性の調査に役立ち、その利便性と操作が容易なため、ストレス条件下での活性酸素種(ROS)決定?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、韓国科学技術大学院大学の壁内研究助成金(2E29563)によって支援された。
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
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