कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस की आंतों की परगम्यता पर बैक्टीरिया और रसायनों के प्रभाव को मापना
Summary
इस प्रोटोकॉल में बताया गया है कि कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंसकी आंतों की परगम्यता को कैसे मापा जाए । यह विधि आंतों के बैक्टीरिया और उनके मेजबान के बीच बातचीत से संबंधित आंतों के स्वास्थ्य पर बुनियादी जैविक अनुसंधान के लिए और टपका हुआ आंत सिंड्रोम और भड़काऊ आंत्र रोगों का इलाज करने के लिए प्रोबायोटिक और रासायनिक एजेंटों की पहचान करने के लिए स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है।
Abstract
जीवित जीवों में आंतों की हाइपरपरेबिलिटी एक गंभीर लक्षण है जिससे कई भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) हो जाते हैं। कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एक नॉनमैट्रिशियन एनिमल मॉडल है जिसे व्यापक रूप से अपनी छोटी उम्र, पारदर्शिता, लागत प्रभावशीलता और पशु नैतिकता के मुद्दों की कमी के कारण परख प्रणाली के रूप में उपयोग किया जाता है। इस अध्ययन में, एक उच्च थ्रूपुट छवि विश्लेषण प्रणाली के साथ सी एलिगेंस की आंतों की पारगम्यता पर विभिन्न बैक्टीरिया और 3,3′-डिंडोलिएलमीथेन (डीआईएम) के प्रभावों की जांच करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी। कीड़े विभिन्न आंत बैक्टीरिया से संक्रमित थे या 48 एच के लिए मंद के साथ सहउपचारित और फ्लोरोसेइन आइसोथिओसाइनेट (फ़ेसीसी) – dextran रातभर के साथ खिलाया जाता है। फिर, धाराप्रवाह स्थायित्व की जांच की गई, जिसमें फ्लोरेसेंस छवियों और कृमि निकायों के अंदर फ्लोरेसेंस तीव्रता की तुलना की गई थी। इस विधि में प्रोबायोटिक और रोगजनक आंतों के बैक्टीरिया की पहचान करने की क्षमता भी हो सकती है जो पशु मॉडल में आंतों की परगम्यता को प्रभावित करते हैं और आंतों की परगम्यता और आंतों के स्वास्थ्य पर हानिकारक या स्वास्थ्य को बढ़ावा देने वाले रसायनों के प्रभावों की जांच करने के लिए प्रभावी है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में आनुवंशिक स्तर पर कुछ काफी सीमाएं भी हैं, विशेष रूप से यह निर्धारित करने के लिए कि कौन से जीन बीमारी को नियंत्रित करने के लिए बदल दिए जाते हैं, क्योंकि इस विधि का उपयोग ज्यादातर फेनोटाइपिक दृढ़ संकल्प के लिए किया जाता है। इसके अलावा, यह विधि यह निर्धारित करने तक सीमित है कि रोगजनक सब्सट्रेट्स सूजन का कारण बनते हैं या संक्रमण के दौरान कीड़े की आंतों की स्थायित्व में वृद्धि करते हैं। इसलिए, उत्परिवर्ती बैक्टीरिया और सूत्रकृमि के साथ-साथ बैक्टीरिया के रासायनिक घटक विश्लेषण का उपयोग करके आणविक आनुवंशिक तंत्र की जांच सहित और गहराई से अध्ययन, आंतों की पारगम्यता का निर्धारण करने में बैक्टीरिया और रसायनों के कार्य का पूरी तरह से मूल्यांकन करने की आवश्यकता होती है ।
Introduction
आंतों की परगम्यता को आंतों के माइक्रोबायोटा और म्यूकोसल प्रतिरक्षा से संबंधित मुख्य बाधाओं में से एक माना जाता है और आंत माइक्रोबायोटा संशोधनों, विशेषण हानि, या बलगम परत परिवर्तन जैसे कई कारकों से प्रभावित होने की संभावना है। हाल के कागजात प्रभावी प्रोटोकॉल की सूचना दी है आंतों सेल परत2भर में फ्लोरेसेंस प्रवाह दरों का विश्लेषण करके सुसंस्कृत मानव आंतों की कोशिकाओं की आंतों की पारगम्यता को मापने के लिए, लेकिन कम शोध पत्र नेमाटोड में आंत पारगम्यता को मापने के लिए एक उपयुक्त प्रक्रिया पेश करते हैं, विशेष रूप से सी एलिगेंसमें, FITC-dextran धुंधला का उपयोग करके ।
नील लाल3 और एरोग्लोसिन डिसोडियम (या स्मर्फ परख)4,5का उपयोग करके सी एलिगेंस में आंत की परगम्यता को मापने के लिए दो प्रतिनिधि प्रोटोकॉल हैं। इस प्रोटोकॉल में, हमने फिटेक-डीएक्सटन (औसत आणविक वजन 10,000) का उपयोग किया, जिसमें नील लाल (मेगावाट = 318.37) और एरोग्लोसिन डाइसोडियम (मेगावाट = 792.85) की तुलना में बहुत अधिक आणविक वजन है। फिट्सी-ड्ट्रिटन नील लाल या एरोग्लोसिन डाइसोडियम रंगों की तुलना में कार्बोहाइड्रेट जैसे वास्तविक मैक्रोमॉलिक्यूलर पोषक तत्वों के समान है, जो आंतों की परत के माध्यम से अवशोषित होते हैं। एरोग्लोसिन डाइसोडियम (ब्लू स्मर्फ डाइ) से खिलाए गए सी एलिगेंस की आंतों की परगम्यता का बिना फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है। हालांकि, स्मर्फ परख में, मानकीकरण की कमी के कारण आंतों की पारगम्यता का मात्रात्मक विश्लेषण मुश्किल है और मैन्युअल रूप से4,5का मूल्यांकन किया जाना चाहिए। नील लाल परख के मामले में, नील लाल भी कोशिकाओं में लिपिड बूंदों दाग, जो सी elegans6में आंत स्थायित्व के सटीक निर्धारण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल अविशिष्ट लिपिड धुंधला से बचने के दौरान विभिन्न आंतों के बैक्टीरिया और रसायनों के साथ इलाज सी एलिगेंस में आंतों की पारगम्यता के तेजी से और सटीक मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम करते हैं।
सी elegans अपनी सस्ती कीमत, आसान हेरफेर, सीमित पशु नैतिकता के मुद्दों, और छोटी उम्र है, जो तेजी से प्रयोग7के लिए फायदेमंद है के कारण जैविक क्षेत्रों में एक ठेठ मॉडल है । विशेष रूप से, पूरे सी एलिगेंस जीनोम प्रकाशित होने के बाद, सी एलिगेंस जीनोम में लगभग 40% जीन जीन के लिए ऑर्थोलॉगस पाए गए जो मानव रोगों का कारण बनते हैं8. इसके अलावा, पारदर्शी शरीर जीव के अंदर अवलोकन की अनुमति देता है, जो सेलुलर घटनाओं पर शोध करने के लिए और सेल जीव विज्ञान में फ्लोरेसेंस अनुप्रयोगों के लिए लाभप्रद है, उदाहरण के लिए, स्टेम सेल DAPI या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री9के साथ धुंधला । सी एलिगेंस का उपयोग अक्सर आंत माइक्रोबायोटा और मेजबान के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक जानवर के रूप में किया जाता है; इसके अलावा, सी एलिगाएनएस का उपयोग स्वास्थ्य को बढ़ावा देने वाले प्रोबायोटिक बैक्टीरिया10,11,12 के साथ-साथ आंतों के स्वास्थ्य को बढ़ावा देने वाले आहार रसायनों को स्क्रीन करने के लिए किया जाता है13,14।
स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और एंटोकोकस मलकालिस प्रसिद्ध आंत बैक्टीरिया हैं जो गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल सिस्टम को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं, विशेष रूप से आंतों के पथ15,16की उपनिवेश एपिथेलियल कोशिकाएं। इसलिए, इन बैक्टीरिया द्वारा ट्रिगर आंत स्थायित्व को मापने के स्क्रीनिंग और नई दवाओं के विकास के लिए आवश्यक है कि ठीक हो सकता है और बैक्टीरियल सूजन और संक्रमण की वजह से नुकसान को कम । इस प्रोटोकॉल में, हमने सी एलिगेंसकी आंतों की परगम्यता पर इन आंतों के बैक्टीरिया के प्रभावों का परीक्षण किया।
हम सी एलिगेंस की आंतों की परगम्यता पर रसायनों के परीक्षण के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल की भी रिपोर्ट करते हैं। इस उद्देश्य के लिए, हमने मॉडल रसायन के रूप में 3,3′-डिइंडोलिएलमीथेन (डीआईएम) का उपयोग किया क्योंकि डीआईएम एक बायोएक्टिव मेटाबोलाइट यौगिक है जो इंडोल-3-कार्बिनॉल से प्राप्त होता है, जो ब्रासिका खाद्य पौधों में मौजूद है, औरचूहों 17,18में आईबीडी पर चिकित्सीय प्रभाव होने की सूचना मिली है। इसके अलावा, हमने हाल ही में पता लगाया कि डीआईएम दोनों सुसंस्कृत मानव आंतों की कोशिकाओं के साथ-साथ मॉडल नेमाटोड सी एलिगेंस19में आंतों की परगम्यता में सुधार करता है।
इस अध्ययन में हमने तीन अलग-अलग प्रायोगिक स्थितियों का इस्तेमाल किया। सबसे पहले, हमने आंतों की परगम्यता(चित्रा 1)पर विभिन्न बैक्टीरिया, पी एरुगिनोसा और ई फेकैलिस के प्रभावों को मापा। दूसरा, हमने आंतों की परगम्यता(चित्रा 2)पर लाइव और हीट-इनएक्टिवेटेड पी एरुजिनोसा के प्रभावों को मापा। तीसरा, हमने पी एरुजिनोसा (चित्रा 3)के साथ खिलाए गए सी एलिगेंस की आंतों की परगम्यता पर डीआईएम (एक मॉडल रसायन) के प्रभाव ों को मापा।
इस अध्ययन का उद्देश्य अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित करना था जो सी एलिगेंसकी आंतों की स्थायित्व को मापते हैं, जिसे विभिन्न आंतों के बैक्टीरिया के साथ-साथ रसायनों के साथ उपचार द्वारा बदल दिया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सी एलिगेंस में आंत पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए इस नई विधि का उपयोग करके, जो स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और मात्रात्मक छवि विश्लेषण को जोड़ती है, आंतों के सूक्ष्मजीवों या रसायनों के का?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को कोरिया इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी इंट्राम्यूरल रिसर्च ग्रांट (2E29563) ने सपोर्ट किया ।
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3′-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3′-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3′-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3′-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
