Измерение воздействия бактерий и химических веществ на кишечную проницаемость Caenorhabditis elegans
Summary
Этот протокол описывает, как измерить кишечную проницаемость Caenorhabditis elegans. Этот метод полезен для фундаментальных биологических исследований по здоровью кишечника, связанных с взаимодействием кишечных бактерий и их хозяина и для скрининга для выявления пробиотических и химических агентов для лечения синдрома вытекающей кишечника и воспалительных заболеваний кишечника.
Abstract
В живых организмах гиперпроницаемость кишечника является серьезным симптомом, который приводит ко многим воспалительным заболеваниям кишечника (IBD). Caenorhabditis elegans является немлекопитающим животных модель, которая широко используется в качестве системы анализа из-за его короткий срок службы, прозрачность, рентабельность и отсутствие вопросов этики животных. В этом исследовании был разработан метод для исследования воздействия различных бактерий и 3,3′-diindolylmethane (DIM) на проницаемость кишечника C. elegans с высокой пропускной способностью системы анализа изображений. Черви были инфицированы различными бактериями кишечника или cotreated с DIM в течение 48 ч и кормили флуоресцен изотиоцианат (FITC)-dextran ночь. Затем проницаемость кишечника была изучена путем сравнения флуоресценции изображений и интенсивности флуоресценции внутри червя органов. Этот метод может также иметь потенциал для выявления пробиотических и патогенных кишечных бактерий, которые влияют на проницаемость кишечника в животной модели и эффективен для изучения влияния вредных или способствующих здоровью химических веществ на проницаемость кишечника и кишечного здоровья. Однако, этот протокол также имеет некоторые значительные ограничения на генетическом уровне, особенно для определения того, какие гены изменяются для контроля болезни, потому что этот метод в основном используется для фенотипического определения. Кроме того, этот метод ограничивается определением того, какие именно патогенные субстраты вызывают воспаление или увеличивают проницаемость кишечника червей во время инфекции. Поэтому для полной оценки функции бактерий и химических веществ при определении проницаемости кишечника необходимы дальнейшие углубленные исследования, включая изучение молекулярно-генетического механизма с использованием мутантных бактерий и нематод, а также анализ химических компонентов бактерий.
Introduction
Проницаемость кишечника считается одним из основных барьеров, связанных с кишечной микробиотой и слизистым иммунитетом и, вероятно, будет зависеть от нескольких факторов, таких как изменения микрофлоры кишечника, эпителиальные нарушения, или изменения слизистого слоя1. Последние документы сообщили эффективные протоколы для измерения кишечной проницаемости культивированных клеток кишечника человека путем анализа флуоресценции поток ставки через слой клеток кишечника2, но меньше научных работ представляют собой подходящую процедуру для измерения проницаемости кишечника в нематод, особенно в C. elegans, с помощью FITC-dextran пятен.
Есть два репрезентативных протокола для измерения проницаемости кишечника в C. elegans с использованием Нила красный3 и erioglaucine динайди (или Smurf асссе)4,5. В этом протоколе мы использовали FITC-dextran (средний молекулярный вес 10 000), который имеет гораздо более высокий молекулярный вес, чем красный Нил (МВс 318,37) и эриоглауцин динайоя (МВт 792,85). FITC-dextran больше похож, чем красный Нил или erioglaucine динатрия красителей фактических макромолекулярных питательных веществ, таких как углеводы, которые поглощаются через кишечный слой. Проницаемость кишечника C. elegans, питаемых с помощью erioglaucine disodium (голубой краситель Smurf), может быть легко оценена без флуоресценционной микроскопии. Однако, в анализе Smurf, количественный анализ кишечной проницаемости затруднен из-за отсутсвия стандартизации и должен быть оценен вручную4,5. В случае Красного нила, Красный Нил также пятна липидных капель в клетках, которые могут помешать точное определение проницаемости кишечника в C. elegans6. Настоящие протоколы позволяют быстро и точно анализировать проницаемость кишечника у C. elegans, обработанных различными кишечными бактериями и химическими веществами, избегая при этом неспецифических липидных окрашивания.
C. elegans является типичной моделью в биологических областях из-за своей доступной цене, легкой манипуляции, ограниченных вопросов этики животных, и короткий срок службы, что выгодно для быстрых экспериментов7. В частности, после публикации всего генома C. elegans, почти 40% генов гена c. elegans были признаны ортологичными для генов, вызывающих заболевания человека8. Кроме того, прозрачный организм позволяет наблюдать внутри организма, что выгодно для исследования клеточных событий и для применения флуоресценции в клеточной биологии, например, окрашивания стволовых клеток с помощью DAPI или иммуногистохимии9. C. elegans часто используется в качестве экспериментального животного для изучения взаимодействия микрофлоры кишечника и хозяина; кроме того, C. elegans используется для проверки здоровья поощрения пробиотических бактерий10,11,12, а также диетические химические вещества содействия здоровья кишечника13,14.
Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis являются известными бактериями кишечника, которые негативно влияют на желудочно-кишечную систему, особенно на кишечные клетки кишечника15,16. Таким образом, измерение проницаемости кишечника, вызванного этими бактериями, необходимо для скрининга и разработки новых препаратов, которые могут восстановить и уменьшить ущерб, причиненный бактериальным воспалением и инфекцией. В этом протоколе мы проверили влияние этих кишечных бактерий на проницаемость кишечника C. elegans.
Мы также сообщаем об оптимизированном протоколе для тестирования химических веществ на проницаемости кишечника C. elegans. Для этой цели мы использовали 3,3′-diindolylmethane (DIM) в качестве модели химического вещества, потому что DIM является биологически активным метаболитом соединение, полученное из индола-3-карбинол, который присутствует в Brassica пищевых растений, и, как сообщается, терапевтическое воздействие на IBD у мышей17,18. Кроме того, мы недавно обнаружили, что DIM улучшает дисфункцию проницаемости кишечника как в культивированных клеток кишечника человека, а также модель нематод C. elegans19.
В этом исследовании мы использовали три различных экспериментальных условия. Во-первых, мы измерили влияние различных бактерий, P. aeruginosa и E. faecalis, на проницаемость кишечника(рисунок 1). Во-вторых, мы измерили влияние живой и теплоинактивированной P. aeruginosa на проницаемость кишечника(рисунок 2). В-третьих, мы измерили влияние DIM (модель химического) на кишечной проницаемости C. elegans кормили с P. aeruginosa (Рисунок 3).
Целью данного исследования было разработать оптимизированные протоколы, которые измеряют проницаемость кишечника C. elegans, которая изменяется путем лечения различными кишечными бактериями, а также с химическими веществами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя этот новый метод определения проницаемости кишечника в C. elegans, который сочетает в себе автоматизированную флуоресцентную микроскопию и количественный анализ изображений, различия, вызванные кишечными микроорганизмами или химическими веществами, могут быть определены…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Корейским институтом науки и техники в интрамуральных исследований грант (2E29563).
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3′-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3′-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3′-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3′-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
