عزل وتوسيع الخلايا التائية القاتلة التي يسببها الخلايا السامة للخلايا السامة لعلاج السرطان
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولًا لتنفيذ عزل وتوسيع خلايا الدم الطرفية أحادية النواة المشتقة من السيتوكين CD3+CD56+ الخلايا القاتلة وتوضيح تأثيرها على السمية السيتومية ضد الخلايا السرطانية الدموية والصلبة باستخدام نظام التدفق الخلوي للتشخيص المختبري.
Abstract
يركز العلاج المناعي الخلوي بالتبني على استعادة التعرف على السرطان عبر الجهاز المناعي ويحسن القتل الفعال للخلايا السرطانية. وقد أفيد القاتل الناجم عن السيتوكين (CIK) T العلاج بالخلايا لممارسة آثار كبيرة السامة للخلايا ضد الخلايا السرطانية والحد من الآثار السلبية للجراحة, الإشعاع, والعلاج الكيميائي في علاجات السرطان. يمكن اشتقاق CIK من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطية (PBMCs) ونخاع العظام ودم الحبل السري. خلايا CIK هي مجموعة فرعية غير متجانسة من الخلايا التائية مع CD3+CD56+ والخصائص الطبيعية للقاتل (NK) التي تشمل مجمع التوافق الأنسجة الرئيسي (MHC) – نشاط مضاد للورم غير المقيد. تصف هذه الدراسة طريقة مؤهلة وقابلة للتطبيق سريرياً وقائمة على التدفق الخلوي للقياس الكمي للقدرة الخلويلة لخلايا CIK المشتقة من PBMC ضد الخلايا السرطانية الدموية والصلبة. في الاستئصال الخلوي، تشارك خلايا CIK في احتضان بنسب مختلفة مع الخلايا السرطانية المستهدفة الملطخة مسبقا. بعد فترة الحضانة ، يتم تحديد عدد الخلايا المستهدفة بواسطة بقعة ملزمة للحمض النووي للكشف عن الخلايا الميتة. تنطبق هذه الطريقة على كل من تطبيقات البحث والتشخيص. تمتلك خلايا CIK سمية سيتومية قوية يمكن استكشافها كاستراتيجية بديلة لعلاج السرطان عند تقييمها قبل السريري من خلال إعداد وتتبع مقياس الخلايا (CS & T) نظام قياس الخلايا القائم على.
Introduction
الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا هي مجموعة خلايا ذات تأثير مناعي محددة تتوسط الاستجابات المناعية ضد السرطان. تم تطوير العديد من مجموعات الخلايا الضارة بما في ذلك الخلايا القاتلة المنشطة من اللمفوكين (LAK) ، والخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs) ، والخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، والخلايا T ، والخلايا القاتلة الناجمة عن السيتوكين (CIK) لأغراض العلاج بالخلايا التائية بالتبني (ACT)1. هناك اهتمام متزايد في خلايا CIK ، لأنها تمثل مزيجًا من مجموعات الخلايا السامة للخلايا الناجمة عن السيتوكين التي توسعت من الخلايا أحادية نووية الدم المحيطية الذاتية (PMBCs)2.
يؤدي النمو غير المنضبط لخلايا السلف اللمفاوية والمايلوبلاست والأورام اللمفاوية إلى ثلاثة أنواع رئيسية من سرطان الدم (أي سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية والمايلوما) والأورام الصلبة ، بما في ذلك السرطانات (على سبيل المثال ، سرطان الرئة ، سرطان المعدة ، سرطان عنق الرحم) ، والساركومات ، من بين أنواع أخرى من السرطانات3. خلايا CIK هي مزيج من مجموعات الخلايا التي تحمل مجموعة واسعة من مجمع التوافق الهيستيك الرئيسي (MHC) – نشاط مضاد للورم غير المقيد وبالتالي تحمل الوعد لعلاج الأورام الدموية والمتقدمة4،5،6،7. خلايا CIK تتألف من مزيج من الخلايا، بما في ذلك الخلايا التائية (CD3+CD56−)، NK-T الخلايا (CD3+CD56+)، وخلايا NK (CD3–CD56+). التحسين من بروتوكول التعريفي CIK باستخدام جدول زمني ثابت بالإضافة إلى IFN-ο، الأجسام المضادة CD3، وIL-2، يؤدي إلى توسيع خلايا CIK8. القدرة السامة للخلايا CIK ضد الخلايا السرطانية يعتمد أساسا على مشاركة NK المجموعة 2 عضو D (عضو في الأسرة مستقبلات C-نوع ليكتين مثل) لغاند NKG2D على الخلايا السرطانية, وعلى مسارات perforin بوساطة9. وكشفت نتائج دراسة ما قبل السريرية أن IL-15-حفز خلايا CIK تسبب السمية الخلوية قوية ضد خطوط خلايا سرطان الدم النخاعي الأولية والحادة في المختبر وأظهرت انخفاض alloreactivity ضد PBMCs العاديوالخلايا الليفية9. في الآونة الأخيرة ، تم نشر نتيجة CIK المشتقة من المتبرع الصحي لمرة واحدة (1 × 108/ كجم CD3+ الخلايا) التسريب كدمج بعد زرع الخلايا الجينية غير النخاعية لعلاج الأورام النخاعية في دراسة سريرية المرحلة الثانية10.
في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير صيغة زراعة الخلايا المحسنة المكونة من IFN-ο ، IL-1α ، الأجسام المضادة CD3 ، وIL-2 المضافة إلى وسط الخلية المكونة للدم لزيادة إنتاج CIK ، وحقق تأثير الخلايا السامة للخلايا ضد الإنسان المزمن سرطان الدم النخاعي (K562) الخلايا وسرطان المبيض (OC-3) الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموصوفة هي بروتوكول سريع ومريح وموثوق به لعزل وتوسيع الخلايا القاتلة الناجمة عن السيتوكين (CIK) من عينات الدم الكاملة للمتبرعين الأصحاء. كما أنه يظهر تأثير السمية للخلايا من CIK ضد سرطان الدم (K562) وخلايا سرطان المبيض (OC-3) باستخدام تدفق الإعداد الخلوي وتتبع النظام (CS & T). يمكن حث خلايا CI…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل مستشفى الجامعة الطبية الصينية (DMR-Cell-1809).
Materials
| 7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | ||
| APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | SN: R33896202856 | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO | |
| D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | Basal medium for OC-3 cell culture | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | Density gradient solution | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 | |
| Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 | Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C. | |
| Proleukin | NOVARTIS | Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | ||
| Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | |
| Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C | |
| Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | ||
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature | |
| X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q | Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C |
References
- Cappuzzello, E., et al. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells. Cytokine & Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).
- Schmidt-Wolf, R. S., et al. Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers. British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).
- Grainger, S., et al. Wnt Signaling in Hematological Malignancies. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).
- Dai, C., et al. Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer. Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).
- Schmidt-Wolf, I. G., et al. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).
- Introna, M., et al. Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).
- Schmeel, L. C., et al. Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC). Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).
- Rutella, S., et al. Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol. Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).
- Nausch, N., et al. NKG2D ligands in tumor immunity. Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).
- Gammaitoni, L., et al. Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features. Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).
- Rettinger, E., et al. The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells. Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).
- Narayan, R., et al. Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).
- Castiglia, S., et al. Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).
- Bonanno, G., et al. Thymoglobulin, interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures. Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).
- Iudicone, P., et al. Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway. Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).
- Liu, J., et al. Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion. PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).
- Chen, D., et al. Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer. Cell Death & Disease. 9 (3), 366 (2018).
- Tario, J. D. Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection. Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).
- Last’ovicka, J., et al. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Yoshida, T., et al. Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity. Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).
