Isolering og udvidelse af cytotoksiske cytokin-induceret Killer T Celler til kræftbehandling

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at udføre isolering og udvidelse af perifere blod mononukleare celler-afledt cytokin-induceret CD3⁺CD56⁺ killer celler og illustrere deres cytotoksicitet virkning mod hæmatologiske og faste kræftceller ved hjælp af en in vitro diagnose flow cytometri system.

Abstract

Adoptivcelleimmunterapi fokuserer på at genoprette kræftanerkendelse via immunsystemet og forbedrer effektiv tumorcelledrab. Cytokin-induceret killer (CIK) T celle terapi er blevet rapporteret til at udøve betydelige cytotoksiske virkninger mod kræftceller og at reducere de negative virkninger af kirurgi, stråling og kemoterapi i kræftbehandlinger. CIK kan udledes af perifere blodmononukleare celler (PBPC’er), knoglemarv og navlestrengsblod. CIK celler er en heterogen subpopulation af T-celler med CD3⁺CD56⁺ og naturlige killer (NK) fænotypiske egenskaber, der omfatter store histokompatibilitet kompleks (MHC)-ubegrænset antitumor aktivitet. Denne undersøgelse beskriver en kvalificeret, klinisk anvendelig, flow cytometri-baseret metode til kvantificering af den cytolytiske evne pbmc-afledte CIK celler mod hæmatologiske og faste kræftceller. I den cytolytiske analyse, cik celler er co-inkuberet på forskellige nøgletal med prestained mål tumorceller. Efter inkubationstiden bestemmes antallet af målceller af en nukleinsyrebindende plet for at detektere døde celler. Denne metode gælder for både forsknings- og diagnosticeringsapplikationer. CIK celler besidder potent cytotoksicitet, der kunne udforskes som en alternativ strategi for kræftbehandling på sin prækliniske evaluering af en cytometer setup og sporing (CS & T) baseret flow cytometri system.

Introduction

Cytotoksiske T lymfocytter er en specifik immuneffekt eller cellepopulation, der formidler immunrespons mod kræft. Flere effektor cellepopulationer, herunder lymphokin-aktiveret killer (LAK) celler, tumor-infiltrerende lymfocytter (TILs), naturlige killer (NK) celler, γδ T celler, og cytokin-induceret killer (CIK) celler er blevet udviklet til adoptivT celle terapi (ACT) formål¹. Der er en stigende interesse for CIK celler, fordi de repræsenterer en blanding af cytokin-induceret cytotoksiske cellepopulationer udvidet fra autolog perifere blod mononukleare celler (PMBC)².

Den ukontrollerede vækst af lymfoide progenitor celler, myeloblaster, og lymfoblaster fører til tre hovedtyper af blodkræft (dvs. leukæmi, lymfom, og myelomatose), solide tumorer, herunder karcinomer (f.eks lungekræft, mavekræft, livmoderhalskræft), og sarkomer, blandt andre kræftformer³. CIK celler er en blanding af cellepopulationer, der udviser en bred vifte af store histokompatibilitet kompleks (MHC)-ubegrænset antitumor aktivitet og dermed holde løfte om behandling af hæmatologiske og avancerede tumorer^4,5,6,7. CIK celler omfatter en kombination af celler, herunder T-celler (CD3⁺CD56⁻), NK-T celler (CD3⁺CD56⁺), og NK celler (CD3^–CD56⁺). Optimering af CIK induktion protokol ved hjælp af en fast tidsplan for tilsætning af IFN-γ, anti-CD3 antistof, og IL-2, resulterer i udvidelse af CIK celler⁸. Cik-cellernes cytototoksiske evne til at bekæmpe kræftceller afhænger hovedsageligt af, at NK-gruppe 2-medlemmet D (medlem af C-typen lectin-lignende receptorfamilie) nkg2d ligands på tumorceller og på perforinmedierede veje⁹. Resultaterne af en præklinisk undersøgelse viste, at IL-15-stimulerede CIK-celler induceret potent cytotoksicitet mod primære og akutte myeloid leukæmi cellelinjer in vitro og udstillet en lavere alloreaktivitet mod normale PBPC’er og fibroblaster⁹. For nylig, resultatet af engangs-sund donor-afledt CIK (1 x 10⁸/ kg CD3⁺ celler) infusion som konsolidering efter nonmyeloablative allogen transplantation for myeloid neoplasmbehandling i en fase II klinisk undersøgelse blev offentliggjort¹⁰.

I denne undersøgelse udviklede vi en optimeret cellekulturformel bestående af IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 antistof og IL-2, der blev tilføjet til det hæmatopoietiske cellemedium for at øge CIK-produktionen, og undersøgte cikcellernes cytotoksiske virkning mod kroniske mennesker myeloid leukæmi (K562) celler og kræft i æggestokkene (OC-3) celler.

Protocol

Den kliniske protokol blev udført og godkendt i overensstemmelse med retningslinjerne fra Den Institutionelle Review Board for China Medical University and Hospital Research Ethics Committee. Perifere blodprøver blev høstet fra raske frivillige med deres informerede samtykke. 1. Fremstilling af materialer Opbevar reagenser, antistoffer og kemikalier som vist i materialesikkerhedsdatabladet (MSDS). Stofferne eller cytokinerne opløses i opløsningsmidler som lageropløsninger, og d…

Representative Results

Formålet med denne protokol er at isolere og udvide cytokin-induceret dræber (CIK) T-celler fra perifere blodmonocytter og evaluere ciks cytototoksiske virkning mod henholdsvis hæmatologisk malignitet og faste kræftceller. Induktionen af CIK blev identificeret ved CD3/CD56-genkendelsen. Figur 1A viser protokollen for CIK induktion og ekspansion. De repræsentative resultater af gatingstrategien for analyse af underpopulationen af CD3+CD56+ T-celler …

Discussion

Den beskrevne metode er en hurtig, bekvem og pålidelig protokol for isolering og udvidelse af cytotoksisk cytokin-induceret killer (CIK) T-celler fra fuldblodsprøver af raske donorer. Det viser også den cytotoksiske virkning af CIK mod leukæmi (K562) og kræft i æggestokkene (OC-3) ved hjælp af et flow cytometri setup og sporing (CS & T) system. CIKceller kan induceres og udvides i god produktionspraksis (GMP) betingelser ved hjælp af GMP-grade cytokiner og serum-fri medium for yderligere klinisk infusion<sup clas…

Materials

7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962		SN: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082		Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644		For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Basal medium for OC-3 cell culture
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03		For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK		Density gradient solution
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3	Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122		Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050		Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A		Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085		Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028		Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q		Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C