בידוד והתרחבות של Cy, ציטוטוקאין ציטוטופין המושרה הרוצח T תאים לטיפול בסרטן

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבצע את הבידוד והתרחבות של דם היקפי מונאוטרי תאים-cytokine נגזר המושרה CD3⁺CD56⁺ הרוצח תאים ולהמחיש ההשפעה שלהם באמצעות הרעלה נגד המטולוגית ותאים סרטניים מוצק באמצעות האבחון מחוץ לגוף האבחנה cy, לנסות מערכת.

Abstract

חיסוני הסלולר המאמצת מתמקד בשחזור הכרה בסרטן באמצעות מערכת החיסון ומשפר את הריגת תאים סרטניים יעיל. Cytokine המושרה הרוצח (ק) טיפול תא T דווח להפעיל אפקטים ציטוטוקסיים משמעותיים נגד תאים סרטניים כדי להפחית את ההשפעות השליליות של ניתוח, קרינה, כימותרפיה בטיפול בסרטן. ק. ק. יכול להיות מופק מתאי דם היקפיים (PBMCs), מח עצם ו דם טבורי. תאים מסוג ק הם אוכלוסיית משנה הטרוגנית של תאי T עם CD3⁺CD56⁺ ו הרוצח הטבעי (NK) מאפייני פנוסטימית הכוללים מורכבות היסטליתתאימות העיקריים (mhc)-פעילות אנטי סרטניים בלתי מוגבלת. מחקר זה מתאר מוסמך, קליני ישימה, זרימה cy, המבוסס על השיטה המבוססת על כימות של היכולת cytolytic של תאים הנגזרות PBMC-נגזר נגד תאים סרטניים מוצק המטולוגי. בתוך האינטגרל cytolytic, התאים של ק. ק. ו. שכונתיות ביחס שונה עם תאים סרטניים היעד מוכתם. לאחר תקופת הדגירה, מספר תאי היעד נקבעים על ידי כתם חומצות הגרעין מחייב לזהות תאים מתים. שיטה זו ישימה הן עבור יישומים מחקריים והן עבור יישומי אבחון. תאים ק בעלי רעילות חזקה שניתן לחקור כאסטרטגיה חלופית לטיפול בסרטן על הערכה טרום קליני שלה על ידי התקנה cytometer מעקב (CS & T) מבוסס זרימה cy, מערכת המערכת.

Introduction

לימפוציטים T ציטוטוקסיים הם מסוימים החיסון החיסונית האוכלוסייה המדיטים תגובות החיסון נגד סרטן. מספר אוכלוסיות של תאים מסוימים, כולל lymphokine המופעל הרוצח (לק) תאים, הגידול החדירה לימפוציטים (TILs), הרוצח הטבעי (NK) תאים, γδ T תאים, ו cytokine המושרה הרוצח (ק) תאים פותחו עבור טיפול תא T המאמצת (ACT) מטרות¹. יש עניין הולך וגדל בתאי ק. ק., כי הם מייצגים תערובת של אוכלוסיות המושרה ציטוטוקסיים הנגרמת מפני הרחבה מתוך דם היקפי בתאי מונטובית (PMBCs)².

הצמיחה בלתי מבוקרת של תאים מחולל הלימפה, מיאלואידית, ו lymphoblasts מוביל שלושה סוגים עיקריים של סרטן הדם (כלומר, לוקמיה, לימפומה, מיאלומה), גידולים מוצקים, כולל קרצינומות (למשל, סרטן ריאות, סרטן קיבה, סרטן צוואר הרחם), ו סרקומות, בין סרטן אחרים³. תאים ק הם תערובת של אוכלוסיות תאים המוצגים מגוון רחב של מורכבות היסטולוגית העיקריים (mhc)-פעילות אנטי סרטניים בלתי מוגבל ובכך להחזיק הבטחה לטיפול בגידולים המטולוגיים ומתקדמים^4,5,6,7. תאי ק מהווים שילוב של תאים, כולל תאי T (CD3⁺CD56-), בתאי Nk-T (CD3⁺CD56^+),ותאי nk (CD3^–CD56⁺). אופטימיזציה של פרוטוקול האינדוקציה ק ‘ ק על ידי שימוש בלוח זמנים קבוע עבור התוספת של IFN-γ, anti-CD3 נוגדן, ו-IL-2, תוצאות ההרחבה של התאים ק^{ח 8}. היכולת ציטוטוקסיני של תאים ק נגד תאים סרטניים בעיקר תלוי באירוסים של הקבוצה NK 2 חבר D (חבר של C-type-סוג לקטין משפחה הקולטן) NKG2D ligands על תאי הגידול, ועל ניקובים בתיווך מסלולים⁹. התוצאות של מחקר טרום קלינית גילה כי תאים ממריצים IL-15-מגורה המושרה הרעלת ציטופוטנטיות חזקות נגד קווי לוקמיה מיאלואידית חמורה וחריפה בתוך מבחנה והציגה alloreactivity נמוכה נגד PBMCs נורמלי ופיברופיצוצים⁹. לאחרונה, את התוצאה של התורם בריא חד פעמי הנגזר ק ג (1 x 10⁸/ק”ג CD3⁺ תאים) אינפוזיה כמו איחוד בעקבות השתלת אלוגנאלומית nonmyeloablative לטיפול מיאלואידית הנאלדיליגיאמים במחקר קליני שלב II פורסמה¹⁰.

במחקר הנוכחי, פיתחנו הנוסחה האופטימיזציה של תרבות התא מורכב IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 נוגדן, ו-IL-2 התווסף למדיום התא המטפיאה כדי להגדיל את הייצור של ק. ק., וחקר את ההשפעה ציטוטוקסיני של תאים ק נגד כרונית אנושית לוקמיה מיאלואידית (K562) תאים וסרטן השחלות (OC-3) תאים.

Protocol

הפרוטוקול הקליני בוצע ואושר בהתאם להנחיות של מועצת הסקירה המוסדית של האוניברסיטה הרפואית בסין וועדת האתיקה של בית החולים. דגימות דם היקפיים נקצרו ממתנדבים בריאים עם הסכמתם הודיעו. 1. הכנת חומרים אחסן ריאגנטים, נוגדנים וכימיקלים כמתואר בגיליון נתוני בטיחות חומרים (MSDS)….

Representative Results

המטרה של הפרוטוקול הנוכחי היא לבודד ולהרחיב את הרוצח cytokine המושרה (ק) תאים מונוציטים דם היקפי ולהעריך את ההשפעה ציטוטוקסיק נגד ממאירות המטולוגית ותאים סרטניים מוצק, בהתאמה. האינדוקציה של ק. ק. זוהתה על-ידי הכרה CD3/CD56. איור 1A מראה את הפרוטוקול עבור השראה והתרחבות. תוצ?…

Discussion

השיטה המתוארת היא פרוטוקול מהיר, נוח ואמין עבור בידוד והתרחבות של הרוצח ציטוקין cy, הנגרמת המושרה (ק) תאים מדגימות דם שלמות של תורמים בריאים. זה גם מראה את ההשפעה ציטוטוקסיק נגד לוקמיה (K562) ו סרטן השחלות תאים (OC-3) באמצעות זרימה cy, התקנה ומעקב אחר (CS & T) מערכת. תאים ק יכול להיות המושרה והרחיב בשיט?…

Materials

7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962		SN: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082		Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644		For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Basal medium for OC-3 cell culture
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03		For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK		Density gradient solution
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3	Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122		Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050		Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A		Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085		Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028		Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q		Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C