Isolamento ed espansione delle cellule T Killer citotokine indotte da citokine per il trattamento del cancro

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire l’isolamento e l’espansione delle cellule mononucleari periferiche derivate dalle cellule citochine- indotte CD3^–CD56^– cellule killer e illustrare il loro effetto di citotossicità contro le cellule tumorali ematologiche e solide utilizzando un sistema di citometria di flusso di diagnosi invitro.

Abstract

L’immunoterapia cellulare adottiva si concentra sul ripristino del riconoscimento del cancro tramite il sistema immunitario e migliora l’uccisione efficace delle cellule tumorali. La terapia con cellule T indotta da citochine (CIK) per esercitare effetti citotossici significativi contro le cellule tumorali e per ridurre gli effetti negativi della chirurgia, delle radiazioni e della chemioterapia nei trattamenti contro il cancro. Il CIK può essere derivato da cellule mononucleari periferiche del sangue (PBMC), midollo osseo e sangue del cordone ombelicale. Le cellule CIK sono una sottopopolazione eterogenea di cellule T con CD3^–CD56^e caratteristiche fenotipiche natural killer (NK) che includono l’attività antitumorale senza restrizioni del complesso di istocompatibilità (MHC). Questo studio descrive un metodo qualificato, clinicamente applicabile, basato sulla citometria di flusso per la quantificazione della capacità citolytica delle cellule CIK derivate da PBMC contro le cellule tumorali ematologiche e solide. Nel saggio citolitico, le cellule CIK sono co-incubate a diversi rapporti con cellule tumorali bersaglio prestainte. Dopo il periodo di incubazione, il numero di cellule bersaglio è determinato da una macchia legante acido nucleico per rilevare le cellule morte. Questo metodo è applicabile sia alle applicazioni di ricerca che a quella diagnostica. Le cellule CIK possiedono una potente citotossicità che potrebbe essere esplorata come strategia alternativa per il trattamento del cancro dopo la sua valutazione preclinica da parte di un sistema di citometria basato su citometro (CS & T).

Introduction

I linfociti Citotossici sono una popolazione specifica di cellule eretritarie immunitarie che mediano le risposte immunitarie contro il cancro. Diverse popolazioni di cellule efleganti, tra cui cellule killer attivate da linfocini (LAK), linfociti infiltrati di tumore (TIL), cellule NK , cellule di z T, e cellule killer indotta da citochine (CIK) sono stati sviluppati per scopi di terapia at-cellule adottivi (ACT)¹. C’è un crescente interesse per le cellule CIK, perché rappresentano una miscela di popolazioni di cellule citototossiche indotte da citochine espanse da cellule mononucleari del sangue periferico autologhe (PMBC)².

La crescita incontrollata di cellule progenitrici linfoidi, mieloblasti e linfoblasti porta a tre principali tipi di tumori del sangue (ad esempio leucemia, linfoma e mieloma), tumori solidi, tra cui carcinomi (ad esempio, cancro del polmone, cancro gastrico, cancro cervicale) e sarcomi, tra gli altri cancri³. Le cellule CIK sono una miscela di popolazioni cellulari che presentano una vasta gamma di attività antitumorali unrestricted complex (MHC) -unrestricted e quindi promettono per il trattamento dei tumori ematologici e avanzati^4,5,6^,7. Le celle CIK sono costituite da una combinazione di celle, tra cui le celle T (CD3^,CD56^),le cellule NK-T (CD3^,CD56) e le cellule NK (CD3^–CD56⁾. L’ottimizzazione del protocollo di induzione del CIK mediante l’uso di un programma fisso per l’aggiunta di anticorpi IFN-z, anti-CD3 e IL-2, comporta l’espansione delle cellule CIK⁸. La capacità citototossica delle cellule CIK contro le cellule tumorali dipende principalmente dall’impegno del membro D del gruppo NK 2 (un membro della famiglia di recettori simili alla lectina di tipo C) ligando NKG2D sulle cellule tumorali e sulle vie mediate da perforina⁹. I risultati di uno studio preclinico hanno rivelato che le cellule CIK stimolate da IL-15 hanno indotto la potente citotossicità potente contro le linee cellulari della leucemia mieloide primaria e acuta in vitro e hanno mostrato una minore alloreattività contro i normali PBMC e i fibroblasti⁹. Recentemente, è stato pubblicato il risultato dell’infusione di CIK (1 x 10⁸/kg di^cellule CD3) come consolidamento a seguito del trapianto allogeneico non mieloablativo per il trattamento dei neoplasmi mieloidi in uno studio clinico di fase II.

Nel presente studio, abbiamo sviluppato una formula di coltura cellulare ottimizzata composta da ifN-z, IL-1, anticorpi anti-CD3, e IL-2 aggiunto al mezzo cellulare ematopoietico per aumentare la produzione di CIK, e studiato l’effetto citotossico delle cellule CIK contro le malattie umane croniche leucemia mieloide (K562) cellule e cellule tumorali ovariche (OC-3).

Protocol

Il protocollo clinico è stato eseguito e approvato in conformità con le linee guida del Institutional Review Board della China Medical University and Hospital Research Ethics Committee. Gli esemplari di sangue periferico sono stati raccolti da volontari sani con il loro consenso informato. 1. Preparazione dei materiali Conservare reagenti, anticorpi e sostanze chimiche, come mostrato nella scheda dati sulla sicurezza dei materiali (MSDS). Sciogliere i farmaci o le citochine nei sol…

Representative Results

Lo scopo del presente protocollo è quello di isolare ed espandere le cellule T killer indotte da citochine (CIK) dai monociti del sangue periferici e valutare l’effetto citotossico del CIK contro la malignità ematologica e le cellule tumorali solide, rispettivamente. L’induzione del CIK è stata identificata dal riconoscimento CD3/CD56. Figura 1A mostra il protocollo per l’induzione e l’espansione CIK. I risultati rappresentativi della strategia di gating per l’analisi del…

Discussion

Il metodo descritto è un protocollo veloce, conveniente e affidabile per l’isolamento e l’espansione di cellule T killer citotototossiche indotte da citotozi (CIK) da campioni di t di donatori sani. Mostra anche l’effetto citotossico del CIK contro la leucemia (K562) e le cellule tumorali ovariche (OC-3) utilizzando un sistema di localizzazione e tracciamento della citometria a flusso (CS & T). Le cellule CIK possono essere indotte ed espanse in buone pratiche manufactoryli (GMP) utilizzando citochine di grado GMP e mez…

Materials

7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962		SN: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082		Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644		For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Basal medium for OC-3 cell culture
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03		For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK		Density gradient solution
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3	Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122		Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050		Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A		Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085		Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028		Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q		Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C