癌治療のための細胞傷害性サイトカイン誘発キラーT細胞の分離と拡張

Summary

ここでは、末梢血単核細胞由来のサイトカイン誘導CD3+CD56+キラー細胞の単離・増殖を行うプロトコルを提示し、インビトロ診断フローサイトメトリーシステムを用いて血液学的および固形癌細胞に対する細胞毒性効果を示す。

Abstract

養子細胞免疫療法は、免疫系を介して癌の認識を回復することに焦点を当て、効果的な腫瘍細胞死滅を改善する。サイトカイン誘発キラー(CIK)T細胞療法は、癌細胞に対して顕著な細胞毒性作用を及ぼし、癌治療における手術、放射線および化学療法の悪影響を軽減することが報告されている。CIKは末梢血単核細胞(PBMC)、骨髄、臍帯血から誘導することができる。CIK細胞は、CD3+ CD56⁺および自然殺し (NK) 主要な組織適合性複合体 (MHC) 制限のない抗腫瘍活性を含む発現特性を有するT細胞の不均質な亜集団である。本研究は、PBMC由来CIK細胞の細胞分解能力を血球学的および固形癌細胞に対する定量化のための修飾された、臨床的に適用可能なフローサイトメトリーベースの方法について説明する。細胞分解アッセイでは、CIK細胞は、前染色された標的腫瘍細胞との異なる比率で共培養される。インキュベーション期間後、標的細胞数は、死細胞を検出する核酸結合染色によって決定される。この方法は、研究アプリケーションと診断アプリケーションの両方に適用できます。CIK細胞は、細胞計のセットアップとトラッキング(CS&T)ベースのフローサイトメトリーシステムによる前臨床評価で、がん治療の代替戦略として探求できる強力な細胞毒性を有しています。

Introduction

細胞傷害性Tリンパ球は、癌に対する免疫応答を媒介する特異的な免疫エフェクター細胞集団である。いくつかのエフェクター細胞群は、リンパ球活性化キラー(LAK)細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TILs)、ナチュラルキラー(NK)細胞、γδT細胞、およびサイトカイン誘発キラー(CIK)細胞を含む、養子T細胞療法(ACT)の目的のために開発^された。CIK細胞に対する関心が高まっているのは、サイトカイン誘発細胞傷害性細胞集団の混合物を表すため、自己性末梢血単核細胞(PMBC)2から拡大される。

リンパ系前駆細胞、骨髄芽細胞、リンパ芽細胞の制御不能な増殖は、3種類の血液癌(白血病、リンパ腫、骨髄腫)、癌腫を含む固形腫瘍(例えば、肺癌、胃癌、子宮頸癌)、および肉腫の³つの主要なタイプにつながる。CIK細胞は、広範囲の主要組織適合性複合体(MHC)-無制限の抗腫瘍活性を示す細胞集団の混合物であり、したがって、造馬学および進行性腫瘍^{4、5、6、7}の治療のための約束を保持する。CIK細胞は、T細胞(CD3⁺CD56^-)、NK-T細胞(CD3⁺CD56^+)、およびNK細胞(CD3^–CD56⁺⁾を含む細胞の組み合わせを含む。IFN-γ、抗CD3抗体、およびIL-2の添加のための固定スケジュールを用いてCIK誘導プロトコルの最適化は、CIK細胞⁸の拡張をもたらす。癌細胞に対するCIK細胞の細胞傷害性は、主にNK群2のメンバーD(C型レクチン様受容体ファミリーのメンバー)の腫瘍細胞上のNKG2Dリガンドの関与に依存し、そしてパーフォリン媒介経路⁹に依存する。前臨床試験の結果、IL-15刺激CIK細胞がインビトロで一次および急性骨髄性白血病細胞株に対して強力な細胞毒性を誘導し、正常PBMCおよび線維芽細胞⁹に対して低い刺激性を示したことが明らかになった。最近、第II相臨床試験における骨髄性新生物治療のための非骨髄異系移植に続く統合として、1回限りの健康ドナー由来CIK(1x 10^8/kgCD3+細胞)の注入の結果^{が発表された}。

本研究では、CIK産生を増加させる造血細胞培地にIFN-γ、IL-1α、抗CD3抗体、IL-2を添加した最適化細胞培養式を開発し、ヒト慢性に対するCIK細胞の細胞傷害作用を調べた。骨髄性白血病(K562)細胞および卵巣癌(OC-3)細胞。

Protocol

臨床プロトコルは、中国医科大学および病院研究倫理委員会の機関審査委員会のガイドラインに従って実施され、承認されました。末梢血標本は、彼らのインフォームド・コンセントを持って健康なボランティアから採取された。 1. 材料の調製 物質安全データシート(MSDS)に示すように、試薬、抗体、および化学物質を保存する。ストック溶液として薬剤またはサ…

Representative Results

本プロトコルの目的は、サイトカイン誘導キラー(CIK)T細胞を末梢血単球から分離・拡張し、血液学的悪性度および固形癌細胞に対するCIKの細胞毒性効果を評価することにある。CIKの誘導は、CD3/CD56認識によって同定された。図 1A は、CIK の誘導と拡張のプロトコルを示しています。健常ドナー由来のCD3+CD56+T細胞の亜集団を分析するためのガ?…

Discussion

記載された方法は、健康なドナーの全血サンプルからの細胞傷害性サイトカイン誘発キラー(CIK)T細胞の分離および拡張のための迅速で便利で信頼性の高いプロトコルである。また、フローサイトメトリーのセットアップおよびトラッキング(CS&T)システムを用いた白血病(K562)および卵巣癌細胞(OC-3)に対するCIKの細胞傷害作用も示す。CIK細胞は、GMPグレードのサイトカインおよび無血清培地をさ?…

Materials

7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962		SN: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082		Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644		For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Basal medium for OC-3 cell culture
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03		For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK		Density gradient solution
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3	Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122		Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050		Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A		Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085		Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028		Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q		Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C