암 치료를 위한 사이토카인 유발 킬러 T 세포의 격리 및 확장

Summary

여기서, 우리는 말초 혈액 단핵 세포의 단핵 세포 유래 사이토카인 유도 CD3⁺CD56⁺ 킬러 세포의 격리 및 확장을 수행하는 프로토콜을 제시하고 시험관 내 진단 유세포 분석 시스템을 사용하여 혈액학적 및 고체 암 세포에 대한 그들의 세포 독성 효과를 예시한다.

Abstract

입양 세포 면역 요법은 면역 계통을 통해 암 인식을 회복하고 효과적인 종양 세포 살해를 향상시키는 데 중점을 둡니다. 사이토카인 유도 살인자 (CIK) T 세포 치료는 암 세포에 대하여 중요한 세포 독성 효력을 발휘하고 암 처리에 있는 수술, 방사선 및 화학요법의 역효과를 감소시키기 위하여 보고되었습니다. CIK는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 및 탯줄 혈액으로부터 유래 될 수 있습니다. CIK 세포는^CD3+CD56+ 및 자연 살인자(NK) 현상형 특성을 가진 T 세포의 이질적인 하위 집단으로 주요 조직 적합성 복합체(MHC)-무제한 항종양 활성을 포함한다. 본 연구는 혈액학적 및 고체 암세포에 대한 PBMC 유래 CIK 세포의 세포용해 능력의 정량화를 위한 적격한, 임상적으로 적용 가능한 유동 세포분석 기반 방법을 기술한다. 세포용해 분석에서, CIK 세포는 미리 염색된 표적 종양 세포와 다른 비율로 공동 배양된다. 잠복기 후, 표적 세포의 수는 핵산 결합 얼룩에 의해 결정되어 죽은 세포를 검출한다. 이 방법은 연구 및 진단 응용 프로그램 모두에 적용할 수 있습니다. CIK 세포는 세포계 설정 및 추적 (CS & T) 기반 유량 세포 측정 시스템에 의한 전임상 평가시 암 치료를위한 대체 전략으로 탐구 될 수있는 강력한 세포 독성을 가지고 있습니다.

Introduction

세포독성 T 림프구는 암에 대하여 면역 반응을 중재하는 특정 면역 이펙터 세포 인구입니다. 림프관 활성화 킬러(LAK) 세포, 종양 침투 림프구(TILs), 자연 살인자(NK) 세포, γδ T 세포 및 사이토카인 유도 킬러(CIK) 세포를 포함하는 몇몇 이펙터 세포 집단은 입양 T 세포 치료(ACT) 목적으로 개발되었다^1. CIK 세포에 대한 관심이 증가하고 있는데, 이는 자가말초혈액단핵세포(PMBC)로부터 확장된 사이토카인 유도 세포 집단의 혼합물을 나타내기 때문이다^2.

림프선 전구 세포의 통제되지 않은 성장, 골수 세포 및 림프구는 혈액 암 (즉, 백혈병, 림프종 및 골수종) 3 가지 주요 유형의 혈액 암, 암종 (예 : 폐암, 위암, 자궁 경부암) 및 육종을 포함한 고형 종양으로 이어진다^3. CIK 세포는 광범위한 주요 조직 적합성 복합체(MHC)-무제한 항종양 활성을 나타내며, 따라서 혈액학적 및 고급 종양의 치료에 대한 약속을 보유하는 세포 집단의^{혼합물이다 4,5,6,7.} CIK 세포는 T 세포(CD3+ CD56^{– –}), NK-T 세포(CD3+ CD56+), 및 NK 세포(CD3- CD56+)를 포함하는 세포의 조합을 포함한다. IFN-γ, 항CD3 항체 및 IL-2의 첨가를 위한 고정 된 스케줄을 이용하여 CIK 유도 프로토콜의 최적화는 CIK 세포의 확장을 초래한다^8. 암세포에 대한 CIK 세포의 세포독성 능력은 주로 NK 군 2부재 D(C형 렉틴 유사 수용체 패밀리의 일원) NKG2D 리간드를 종양 세포 상에서, 및 천포 매개^경로에결합하는 것에 의존한다. 전임상 연구의 결과, IL-15 자극 CIK 세포는 시험관내 1차 및 급성 골수성 백혈병 세포주에 대해 강력한 세포 독성을 유도하고 정상 PBMC 및 섬유아세포에 대해 더 낮은 동열성을^{나타냈다9.} 최근, 단계 II 임상 연구에서 골수성 신생물 치료를 위한 비골수성 동종 이식에 따른 통합으로서 1회 건강한 공여자 유래 CIK(1 x 10^8/kgCD3+ 세포)의 결과가^{발표되었다.}

본 연구에서는 CIK 생산을 증가시키기 위해 조혈 세포 배지에 IFN-γ, IL-1α, 항 CD3 항체 및 IL-2로 구성된 최적화된 세포 배양 포뮬러를 개발하고, 인간 만성에 대한 CIK 세포의 세포독성 효과를 조사했습니다. 골수성 백혈병 (K562) 세포 및 난소암 (OC-3) 세포.

Protocol

임상 프로토콜은 중국 의과 대학 및 병원 연구 윤리위원회의 기관 검토 위원회의 지침에 따라 수행및 승인되었습니다. 말초 혈액 표본은 그들의 통보된 동의를 가진 건강한 자원봉사자에게서 수확되었습니다. 1. 재료의 준비 MSDS(물질 안전 데이터 시트)에 표시된 대로 시약, 항체 및 화학 물질을 저장합니다. 용매에 약물 또는 사이토카인을 재고 용액으로 용해시킨 다?…

Representative Results

본 프로토콜의 목적은 말초 혈액 단핵구로부터 사이토카인 유도 살인자(CIK) T 세포를 분리 및 확장하고 혈액학적 악성 종양 및 고형 암 세포에 대해 CIK의 세포 독성 효과를 각각 평가하는 것이다. CIK의 유도는 CD3/CD56 인식에 의해 확인되었다. 그림 1A는 CIK 유도 및 확장에 대한 프로토콜을 나타낸다. 건강한 공여자로부터CD3+CD56+ T 세포의 하위 집단?…

Discussion

기재된 방법은 건강한 공여자들의 전혈 샘플로부터 세포독성 사이토카인 유도 킬러(CIK) T 세포의 격리 및 확장을 위한 빠르고, 편리하고, 신뢰할 수 있는 프로토콜이다. 또한 유세포분석 설정 및 추적(CS&T) 시스템을 이용한 백혈병(K562) 및 난소암세포(OC-3)에 대한 CIK의 세포독성 효과를 나타낸다. CIK 세포는 GMP 등급 사이토카인 및 무혈청 배지를 사용하여 추가적인 임상 주입을 위해 좋은 제조소 관?…

Materials

7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962		SN: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082		Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644		For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Basal medium for OC-3 cell culture
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03		For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK		Density gradient solution
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3	Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122		Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050		Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A		Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085		Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028		Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q		Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C