Isolasjon og utvidelse av cytotoktoktokin-indusert killer T-celler for kreftbehandling

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å utføre isolasjon og utvidelse av perifert blod mononukleære celler-avledet cytokin-indusert CD3⁺CD56⁺ killer celler og illustrere deres cytotoksiskitet effekt mot hematologiske og solide kreftceller ved hjelp av en in vitro diagnose flyt cytometri system.

Abstract

Adoptivcellulær immunterapi fokuserer på å gjenopprette kreftgjenkjenning via immunsystemet og forbedrer effektiv tumorcelledrap. Cytokin-indusert morder (CIK) T celleterapi har blitt rapportert å utøve betydelige cytotoksiske effekter mot kreftceller og for å redusere de negative effektene av kirurgi, stråling og kjemoterapi i kreftbehandlinger. CIK kan avledes fra perifere blodmononukleære celler (PBMCs), benmarg, og navlestreng blod. CIK celler er en heterogen underpopulasjon av T-celler med CD3⁺CD56⁺ og naturlig killer (NK) fenotypiske egenskaper som inkluderer store histokompatibilitet kompleks (MHC) -ubegrenset antitumor aktivitet. Denne studien beskriver en kvalifisert, klinisk anvendelig, flow cytometribasert metode for kvantifisering av cytolytisk evne til PBMC-avledede CIK-celler mot hematologiske og solide kreftceller. I cytolytisk analyse er CIK-celler koinert i forskjellige forhold med forutforede måltumorceller. Etter inkubasjonsperioden bestemmes antall målceller av en nukleinsyrebindende flekk for å oppdage døde celler. Denne metoden gjelder for både forsknings- og diagnostiske applikasjoner. CIK-celler har potent cytotoksisitet som kan utforskes som en alternativ strategi for kreftbehandling ved sin prekliniske evaluering av et cytometeroppsett og -sporing (CS & T)-basert flytcytometrisystem.

Introduction

Cytotoksiske T-lymfocytter er en spesifikk immuneffekteller cellepopulasjon som formidler immunresponsmot kreft. Flere effector cellepopulasjoner inkludert lymfaokin-aktiverte killer (LAK) celler, tumor-infiltrerende lymfocytter (TILs), naturlige killer (NK) celler, γδ T celler, og cytokin-indusert killer (CIK) celler har blitt utviklet for adoptiv T celleterapi (ACT) formål¹. Det er en økende interesse for CIK-celler, fordi de representerer en blanding av cytokininduserte cytotoksiske cellepopulasjoner utvidet fra autologperifere blodmononukleære celler (PMBCs)².

Den ukontrollerte veksten av lymfode stamceller, myeloblaster og lymfoblaster fører til tre hovedtyper av blodkreft (dvs. leukemi, lymfom og myelom), solide svulster, inkludert karsinomer (f.eks. lungekreft, magekreft, livmorhalskreft) og sarkomer, blant annet kreft³. CIK celler er en blanding av cellepopulasjoner som viser et bredt spekter av store histokompatibilitet smimer (MHC)-ubegrenset antitumor aktivitet og dermed holde løfte om behandling av hematologiske og avanserte svulster^4,5,6,7. CIK celler består av en kombinasjon av celler, inkludert T-celler (CD3⁺CD56^−),NK-T celler (CD3⁺CD56⁺), og NK celler (CD3^–CD56⁺). Optimalisering av CIK induksjonsprotokollen ved bruk av en fast tidsplan for tillegg av IFN-γ, anti-CD3 antistoff og IL-2, resulterer i utvidelse av CIK celler⁸. Cytotoksisk evne til CIK-celler mot kreftceller avhenger hovedsakelig av engasjementet til NK gruppe 2 medlem D (et medlem av C-type lectin-lignende reseptor familie) NKG2D ligands på tumorceller, og på perforin-medierte veier⁹. Resultatene av en preklinisk studie viste at IL-15-stimulerte CIK-celler induserte potent cytotoksisitet mot primære og akutte myelogen leukemi cellelinjer in vitro og viste en lavere alloreaktivitet mot normale PBMCs og fibroblaster⁹. Nylig ble utfallet av engangs sunn donor-avledet CIK (1 x 10⁸/ kg CD3⁺ celler) infusjon som konsolidering etter nonmyeloabliv allogen transplantasjon for myelogen neoplasmer behandling i en fase II klinisk studie publisert¹⁰.

I den nåværende studien utviklet vi en optimalisert cellekulturformel bestående av IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 antistoff og IL-2 lagt til hematopoetisk cellemedium for å øke CIK-produksjonen, og undersøkte den cytotoksiske effekten av CIK-celler mot menneskelig kronisk myelogen leukemi (K562) celler og eggstokkreft (OC-3) celler.

Protocol

Den kliniske protokollen ble utført og godkjent i samsvar med retningslinjene til Institutional Review Board i China Medical University and Hospital Research Ethics Committee. Perifere blodprøver ble høstet fra friske frivillige med deres informerte samtykke. 1. Utarbeidelse av materialer Lagre reagenser, antistoffer og kjemikalier som vist i materialsikkerhetsdatabladet (MSDS). Oppløs stoffene eller cytokinene i løsemidler som lagerløsninger og deretter aliquot for lagring ved…

Representative Results

Formålet med den nåværende protokollen er å isolere og utvide cytokin-indusert ei (CIK) T-celler fra perifere blodmonocytter og evaluere cytotoksisk effekt av CIK mot hematologisk malignitet og solide kreftceller. Induksjon av CIK ble identifisert av CD3/CD56-gjenkjenningen. Figur 1A viser protokollen for CIK induksjon og utvidelse. De representative resultatene av gating strategi for å analysere underpopulasjonen av CD3+CD56+ T celler fra friske d…

Discussion

Den beskrevne metoden er en rask, praktisk og pålitelig protokoll for isolasjon og utvidelse av cytokininduserte drapsmann (CIK) T-celler fra hele blodprøver av friske donorer. Det viser også cytotoksisk effekt av CIK mot leukemi (K562) og eggstokkreftceller (OC-3) ved hjelp av en flyt cytometri oppsett og sporing (CS & T) system. CIK celler kan induseres og utvides i gode manufactory praksis (GMP) forhold ved hjelp av GMP-grade cytokiner og serum-fri medium for videre klinisk infusjon¹¹. Effek…

Materials

7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962		SN: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082		Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644		For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Basal medium for OC-3 cell culture
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03		For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK		Density gradient solution
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3	Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122		Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050		Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A		Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085		Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028		Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q		Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C