Isolamento e Expansão de células T assassinas induzidas por citocina para tratamento de câncer

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar o isolamento e expansão de células mononucleares derivadas de citocinas derivadas de citocinas derivadas de citocinas induzidas por citocinas por cdinénsia^{induzidas por}citocinas + CD56⁺ células assassinas e ilustrar seu efeito de citotoxicidade contra células cancerígenas hematológicas e sólidas usando um sistema de citometria de fluxo de diagnóstico in vitro.

Abstract

A imunoterapia celular adotiva se concentra na restauração do reconhecimento do câncer através do sistema imunológico e melhora a efetiva matança de células tumorais. A terapia celular T do assassino induzido por citocinas (CIK) tem sido relatada para exercer efeitos citotóxicos significativos contra células cancerosas e reduzir os efeitos adversos da cirurgia, radiação e quimioterapia em tratamentos de câncer. A CIK pode ser derivada de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs), medula óssea e sangue do cordão umbilical. As células CIK são uma subpopulação heterogênea de células T com CD3⁺CD56⁺ e características fenotimétricas do assassino natural (NK) que incluem grande complexo de histocompatibilidade (MHC) atividade antitumorarestrita. Este estudo descreve um método qualificado, clinicamente aplicável, baseado em citometria de fluxo para a quantificação da capacidade citolítica das células CIK derivadas do PBMC contra células cancerígenas hematológicas e sólidas. No ensaio citolítico, as células CIK são co-incubadas em diferentes proporções com células tumorais alvo prestained. Após o período de incubação, o número de células-alvo são determinados por uma mancha de ligação com ácido nucleico para detectar células mortas. Este método é aplicável tanto a pesquisas quanto às aplicações diagnósticas. As células CIK possuem citotoxicidade potente que poderia ser explorada como uma estratégia alternativa para o tratamento do câncer após sua avaliação pré-clínica por um sistema de citometria e rastreamento baseado em cítometro (CS & T) sistema de citometria de fluxo baseado em CS & T.

Introduction

Linfócitos T citotóxicos são uma população específica de células de efeito imunológico que media as respostas imunes contra o câncer. Várias populações de células effectoras, incluindo células assassinas ativadas por linfokina (LAK), linfócitos infiltrados em tumores (TILs), células assassinas naturais (NK), células γδ T e células assassinas induzidas por citocina (CIK) foram desenvolvidas para fins adotados de terapia celular T (ACT)¹. Há um crescente interesse em células CIK, porque elas representam uma mistura de populações de células citotóxicas induzidas por citocinas expandidas a partir de células mononucleares sanguíneas autologos periféricas (PMBCs)².

O crescimento descontrolado de células progenitoras linfoides, mieloblastos e linfoblastos leva a três tipos principais de câncer de sangue (ou seja, leucemia, linfoma e mieloma), tumores sólidos, incluindo cancerígenos (por exemplo, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer cervical) e sarcomas, entre outros cânceres³. As células CIK são uma mistura de populações celulares que exibem uma ampla gama de grandes atividades antitumorais (MHC)-irrestritas e, portanto, mantêm a promessa para o tratamento de tumores hematológicos e avançados^4,5,6,7. As células CIK compreendem uma combinação de células, incluindo células T (CD3⁺CD56⁻), células NK-T (CD3⁺CD56⁺) e células NK (CD3^–CD56⁺). A otimização do protocolo de indução CIK usando um cronograma fixo para aadição de anticorpo IFN-γ, anti-CD3 e IL-2, resulta na expansão das células CIK⁸. A capacidade citotóxica das células CIK contra células cancerígenas depende principalmente do engajamento do membro do grupo NK D (um membro da família receptora tipo C) ligands NKG2D em células tumorais, e em caminhos mediados por perforina⁹. Os resultados de um estudo pré-clínico revelaram que as células CIK estimuladas pelo IL-15 induziram citotoxicidade potente contra linhas de leucemia mielóide primária e aguda in vitro e apresentaram menor aloreatividade contra PBMCs normais e fibroblastos⁹. Recentemente, foi^publicadoa infusão do resultado da infusão de CIK derivado de doadores saudáveis (1 x 10⁸/kg de CD3⁺ células) como consolidação após transplante aloloablativo não mieloiático para tratamento de neoplasias mielóides em um estudo clínico de fase II .

No presente estudo, desenvolvemos uma fórmula de cultura celular otimizada composta por IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 e IL-2 adicionadoao meio de células hematopoiéticas para aumentar a produção de CIK, e investigou o efeito citotóxico das células CIK contra a crônica humana células de leucemia mielóide (K562) e células cancerígenas de ovário (OC-3).

Protocol

O protocolo clínico foi realizado e aprovado de acordo com as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Médica e Hospitalar da China. Amostras de sangue periféricas foram colhidas de voluntários saudáveis com seu consentimento informado. 1. Preparação de materiais Reagentes de loja, anticorpos e produtos químicos, como mostrado no Material Safety Data Sheet (MSDS). Dissolva as drogas ou citocinas em solventes como soluç…

Representative Results

O objetivo do protocolo atual é isolar e expandir células T de assassinos induzidos por citocinas a partir de monocitos sanguíneos periféricos e avaliar o efeito citotóxico da CIK contra malignidade hematológica e células cancerígenas sólidas, respectivamente. A indução do CIK foi identificada pelo reconhecimento CD3/CD56. A Figura 1A mostra o protocolo para indução e expansão cik. Os resultados representativos da estratégia de gating para análise da subpopul…

Discussion

O método descrito é um protocolo rápido, conveniente e confiável para o isolamento e expansão de células T de cifras tóxicas induzidas por citocina (CIK) de amostras de sangue inteiro de doadores saudáveis. Também mostra o efeito citotóxico do CIK contra leucemia (K562) e células cancerígenas ovarianas (OC-3) usando um sistema de configuração e rastreamento de citometria de fluxo (CS & T). As células CIK podem ser induzidas e expandidas em boas condições de práticas manufactory (GMP) usando citocinas de…

Materials

7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962		SN: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082		Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644		For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Basal medium for OC-3 cell culture
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03		For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK		Density gradient solution
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3	Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122		Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050		Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A		Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085		Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028		Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q		Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C