Изоляция и расширение цитотоксических цитотинов индуцированных Killer T-клеток для лечения рака

Summary

Здесь мы представляем протокол для выполнения изоляции и расширения периферической крови моноядерных клеток, полученных цитокиновых CD3^cd56– клетки-убийцы и иллюстрируем их цитотоксический эффект против гематологических и твердых раковых клеток с помощью системы цитометрии в пробирке диагностики.

Abstract

Приемная клеточная иммунотерапия фокусируется на восстановлении распознавания рака через иммунную систему и улучшает эффективное убийство опухолевых клеток. Цитокин индуцированных убийца (CIK) Т-клеточная терапия, как сообщается, оказывают значительное цитотоксиче эффекты против раковых клеток и уменьшить неблагоприятные последствия хирургии, радиации и химиотерапии в лечении рака. CIK может быть получен из периферических моноядерных клеток крови (ПБМК), костного мозга и пуповинной крови. Клетки CIK представляют собой разнородную субпопуляцию Т-клеток с CD3^иCD56 и природными фенотипическими характеристиками убийцы (NK), которые включают в себя основные комплексы гистосовместимости (MHC)-неограниченной противоопухолевой активности. Это исследование описывает квалифицированный, клинически применимый, поток цитометрии на основе метода для количественной цитолической способности ПБМК полученных клеток CIK против гематологических и твердых раковых клеток. В цитолическом анализе, клетки CIK совместно инкубируются в различных соотношениях с заранее целевыми опухолевыми клетками. После инкубационного периода, количество клеток-мишеней определяется нуклеиновой кислотой-связывающей пятно для обнаружения мертвых клеток. Этот метод применим как к исследованиям, так и к диагностическим приложениям. Клетки CIK обладают мощной цитотоксичностью, которая может быть изучена в качестве альтернативной стратегии для лечения рака после его доклинической оценки с помощью установки цитометра и отслеживания (CS и T) на основе цитометрии потока системы.

Introduction

Цитотоксические Т-лимфоциты являются специфической популяцией клеток иммунного эффектора, которая опосредует иммунные реакции против рака. Несколько популяций эпреторных клеток, включая лимфокин-активированный убийца (LAK) клетки, опухолевые лимфоциты (TILs), естественные клетки убийцы (НК), Т-клетки, и цитокин-индуцированных убийца (CIK) клетки были разработаны для приемной Т-клеточной терапии (ACT) целей¹. Существует растущий интерес к клеткам CIK, потому что они представляют собой смесь цитокинов индуцированных цитотоксических клеток населения расширена от аутологичных периферических клеток крови (PMBCs)².

Неконтролируемый рост клеток-прародителей лимфоидов, миелобластов и лимфобластов приводит к трем основным видам рака крови (например, лейкемии, лимфомы и миеломы), твердых опухолей, включая рак , рак легких, рак желудка, рак шейки матки) и саркомы, среди других видов рака³. Клетки CIK представляют собой смесь клеточных популяций, которые демонстрируют широкий спектр основных комплекс гистосовместимости (MHC)-неограниченной противоопухолевой активности и, таким образом, держать обещание для лечения гематологических и передовых опухолей^4,5,6,7. Клетки CIK состоят из комбинации ячеек, в том числе Т-клеток (CD3^иCD56^),НК-Т-клеток (CD3^иCD56⁾и НК-клеток (CD3^–CD56). Оптимизация протокола индукции CIK с использованием фиксированного графика для добавления IFN-З, анти-CD3 антител и IL-2, приводит к расширению ciK-клеток⁸. Цитотоксические возможности клеток CIK против раковых клеток в основном зависит от участия НК группы 2 член D (член C-типа лектин-подобных рецепторов семьи) NKG2D лиганды на опухолевые клетки, и на перфорин-опосредованных путей⁹. Результаты доклинического исследования показали, что IL-15-стимулировали клетки CIK индуцированной мощной цитотоксичности против первичной и острой миелоидной лейкемии клеточных линий в пробирке и выставлены более низкую алореактивность против нормальных ПБМК и фибробластов⁹. В последнее время, результат ы одноразовый здоровый донора полученных CIK (1 х 10⁸/ кг CD3^– клетки) инфузии, как консолидация после немиелоаблятивной аллогенной трансплантации для лечения миелоидных неоплазм в фазе II клинического исследования было опубликовано¹⁰.

В настоящем исследовании мы разработали оптимизированную формулу культуры клеток, состоящую из IFN-Я, IL-1, антител анти-CD3 и IL-2, добавленных в гематопоиетическую среду для увеличения производства CIK, и исследовали цитотоксический эффект клеток CIK против хронических человеческих миелоидный лейкоз (K562) клетки рака яичников (OC-3) клеток.

Protocol

Клинический протокол был выполнен и утвержден в соответствии с руководящими принципами Институционального наблюдательного совета Китайского медицинского университета и Комитета по этике исследований больниц. Образцы периферийной крови были собраны у здоровых добровольцев с их инф…

Representative Results

Цель юристого протокола состоит в том, чтобы изолировать и расширить цитокин-индуцированных киллеров (CIK) Т-клеток из периферических моноцитов крови и оценить цитотоксический эффект CIK против гематологической злокачественности и твердых раковых клеток, соответственно. Индукция CIK был?…

Discussion

Описанный метод представляет собой быстрый, удобный и надежный протокол для изоляции и расширения цитотоксических цитокинов- индуцированных киллером (CIK) Т-клеток из цельных образцов крови здоровых доноров. Он также показывает цитотоксический эффект CIK против лейкемии (K562) и раковых кл…

Materials

7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962		SN: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082		Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644		For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Basal medium for OC-3 cell culture
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03		For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK		Density gradient solution
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3	Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122		Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050		Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A		Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085		Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028		Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q		Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C