In vitro-beredning av rumslig cell kontakt mönster med isolerad Caenorhabditis elegans embryo Blastomeres och lim polystyren pärlor
Summary
Vävnad komplexitet flercelliga system blanda ihop identifieringen av orsakssambandet mellan extracellulära signaler och enskilda cellulära beteenden. Här presenterar vi en metod för att studera den direkta kopplingen mellan kontakt beroende ledtrådar och divisions axlar med hjälp av C. elegans embryo blastomerer och lim polystyren pärlor.
Abstract
I flercelliga system, är enskilda celler omgivna av olika fysiska och kemiska signaler som kommer från angränsande celler och miljön. Denna vävnad komplexitet blandar ihop identifieringen av orsakssambandet mellan extrinsic signaler och cellulära dynamik. Ett syntetiskt rekonstituerat multicellulära system övervinner detta problem genom att göra det möjligt för forskare att testa för en specifik Cue samtidigt eliminera andra. Här presenterar vi en metod för att rekonstruera cell kontakt mönster med isolerade Caenorhabditis elegans biopsi och lim polystyren pärlor. Procedurerna innebär äggskal avlägsnande, biopsi isolering genom att störa cell-cell adhesion, beredning av lim polystyren pärlor, och beredning av cell-cell eller cell-pärla kontakt. Slutligen presenterar vi tillämpningen av denna metod för att undersöka inriktningen av cellulära Division axlar som bidrar till regleringen av rumsliga cellulära mönster och cell öde specifikation i utvecklingen av embryon. Denna robusta, reproducerbara och mångsidiga in vitro-metod möjliggör studiet av direkta relationer mellan rumslig cell kontakt mönster och cellulära svar.
Introduction
Under den flercelliga utvecklingen specificeras de cellulära beteendena (t. ex. divisions axeln) för enskilda celler av olika kemiska och fysiska signaler. För att förstå hur enskilda celler tolkar denna information, och hur de reglerar flercelliga sammansättningen som en framväxande egenskap är ett av de ultimata målen för morfogenes studier. Modellorganismen C. elegans har bidragit avsevärt till förståelsen av cellulära nivåreglering av morfogenes såsom cell polaritet1, celldelning mönstringen1, cell öde beslut2, och vävnad skala förordningar såsom neuronala ledningar3 och organogenes4,5. Även om det finns olika genetiska verktyg tillgängliga, vävnadstekniska metoder är begränsade.
Den mest framgångsrika vävnadstekniska metoden i C. elegans studien är den klassiska biopsi isolering6; som C. elegans embryo är omgiven av en äggskal och en permeabilitet barriär7, är deras avlägsnande en av de viktigaste förfarandena för denna metod. Denna metod för biopsi-isolering möjliggör beredning av cell cells kontakt på ett förenklat sätt, men den tillåter inte eliminering av oönskade ledtrådar. cell kontakt fortfarande utgör både mekanisk (t. ex. vidhäftning) och kemiska signaler, vilket begränsar vår förmåga att helt analysera orsakssambandet mellan Cue och cellulära beteende.
Den metod som presenteras i detta dokument använder karboxylate modifierade polystyren pärlor som kovalent binda till någon Amine-reaktiva molekyler inklusive proteiner som ligander. Speciellt använde vi en Amin-reaktiv form av Rhodamine Red-X som en ligand att göra pärlor både visuellt spårbar och lim till cellen. Karboxylgrupperna av pärlyta och primära amingrupper av ligand-molekylen är sammankopplade med vattenlösliga karbodiimidgrupp 1-etyl-3-(dimetylaminopropyl) karbodiimidgrupp (edac)8,9. Erhållna självhäftande pärlor möjliggöra effekterna av den mekaniska Cue på cellulära dynamik10. Vi har använt denna teknik för att identifiera mekaniska signaler som krävs för celldelning orientering10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beredning av förenklade cell kontakt mönster kommer att låta forskarna att testa rollerna för specifika cell kontakt mönster i olika aspekter av morfogenes. Vi har använt denna teknik för att visa att cell Division Axis styrs av den fysiska kontakten med självhäftande pärlor10. Som Division Axis specifikation är avgörande för multicellulära utveckling genom att bidra till morfogenes14, Stem cell Division15,1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar James Priess och Bruce Bowerman för råd och ger c. elegans stammar, Don Moerman, Kota Mizumoto, och Life Sciences Institute Imaging Core anläggning för att dela utrustning och reagenser, AOI Hiroyasu, Lisa Fernando, min JEE Kim för underhåll av c. elegans och kritisk läsning av vårt manuskript. Vårt arbete stöds av naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
Materials
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
- Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
- McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
- Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
- Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
- Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
- Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
- Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
- Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux’s Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
- Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
- Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
- Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
- Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).
