In vitro-rekonstituering av romlig celle kontakt mønstre med isolert Caenorhabditis elegans embryo Blastomeres og selvklebende polystyren perler
Summary
Tissue kompleksiteten i flercellede systemer forvirre identifisering av årsakssammenheng mellom ekstracellulære signaler og individuell mobilnettet atferd. Her presenterer vi en metode for å studere direkte kobling mellom kontakt-avhengige signaler og divisjon akser ved hjelp av C. elegans embryo blastomeres og selvklebende polystyren perler.
Abstract
I flercellede systemer, individuelle celler er omgitt av ulike fysiske og kjemiske signaler som kommer fra naboceller og miljø. Dette vevet kompleksitet forundrer identifisering av årsakssammenheng mellom ytre signaler og cellulær dynamikk. En syntetisk rekonstituert flercellede system overvinner dette problemet ved å la forskere til å teste for en bestemt stikkordet mens eliminere andre. Her presenterer vi en metode for å Rekonstituer celle kontakt mønstre med isolerte Caenorhabditis elegans blastomere og selvklebende polystyren perler. Prosedyrene innebærer eggeskall fjerning, blastomere isolasjon ved å forstyrre celle-celle vedheft, utarbeidelse av selvklebende polystyren perler, og rekonstituering av celle-celle eller celle-perle kontakt. Til slutt presenterer vi anvendelsen av denne metoden for å undersøke orienteringen av mobilnettet divisjon akser som bidrar til regulering av romlige cellulære mønstre og celle skjebne spesifikasjon i å utvikle embryo. Denne robuste, reproduserbar og allsidig in vitro-metoden gjør det mulig å studere direkte relasjoner mellom kontakt mønstre for romlige celler og cellulære svar.
Introduction
Under flercellede utvikling, mobilnettet atferd (f. eks divisjon akse) av individuelle celler er spesifisert av ulike kjemiske og fysiske signaler. For å forstå hvordan enkelte celle tolker denne informasjonen, og hvordan de regulerer flercellede forsamlingen som en emergent eiendom er et av de ultimate målene for morphogenesis studier. Modellen organisme C. elegans har bidratt betydelig til forståelsen av celle-nivåregulering av morphogenesis som celle polaritet1, celle divisjon mønster1, celle skjebne beslutning2, og vevs-skala forskrifter som neuronal kabling3 og organogenesen4,5. Selv om det finnes ulike genetiske verktøy tilgjengelig, vev engineering metoder er begrenset.
Den mest vellykkede vev engineering metode i C. elegans studien er den klassiske blastomere isolasjon6; som C. elegans embryo er omgitt av en eggeskall og en permeabilitet barriere7, er deres fjerning en av de viktigste prosedyrene for denne metoden. Selv om denne blastomere isolasjons metoden muliggjør rekonstituering av celle celle kontakt på en forenklet måte, tillater den ikke eliminering av uønskede stikkord. celle kontakt fortsatt utgjør både mekanisk (for eksempel vedheft) og kjemiske signaler, og dermed begrense vår evne til å fullt ut analysere årsakssammenheng forholdet mellom stikkordet og cellulære atferd.
Metoden som presenteres i denne utredningen bruker carboxylat modifiserte polystyren perler som kan covalently binde til noen Amin-reaktive molekyler inkludert proteiner som ligander. Spesielt brukte vi en Amin-reaktiv form av Rhodamine Red-X som en ligand å lage perler både visuelt sporbar og lim til cellen. Den kar bok syl grupper av perle overflaten og primære Amin grupper av ligand molekyl er ledsaget av vannløselige carbodiimide 1-etanol-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC)8,9. Innhentet selvklebende perler tillate virkningene av den mekaniske stikkordet på mobilnettet dynamikk10. Vi har brukt denne teknikken for å identifisere mekaniske signaler som kreves for celledeling orientering10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rekonstituering av forenklet celle kontakt mønstre vil la forskere til å teste rollene til spesifikke celle kontakt mønstre i ulike aspekter av morphogenesis. Vi har brukt denne teknikken til å vise at celledeling aksen styres av den fysiske kontakten med selvklebende perler10. Som Division Axis spesifikasjonen er avgjørende for flercellede utvikling ved å bidra tilmorphogenesis 14, stilk cellendivisjon 15,16,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker James Priess og Bruce Bowerman for råd og gi C. elegans stammer, Don Moerman, Kota Mizumoto, og Life Sciences Institute Imaging Core Facility for deling av utstyr og reagenser, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, min JEE Kim for vedlikehold av C. elegans og kritisk lesning av manuskriptet vårt. Vårt arbeid er støttet av naturvitenskap og engineering Research Council of Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
Materials
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
- Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
- McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
- Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
- Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
- Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
- Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
- Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
- Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux’s Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
- Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
- Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
- Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
- Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).
