نظام الطرد المركزي التلقائي للتدفق المضاد لمعالجه الخلايا الصغيرة الحجم
Summary
الاتمته هي المفتاح للارتقاء وأداره التكاليف في تصنيع الخلايا. تصف هذه المخطوطة استخدام جهاز معالجه الخلايا الطرد المركزي المضاد للتدفق لاتمته خطوات التبادل المؤقت وتركيز الخلية للمعالجة الحيوية الصغيرة النطاق.
Abstract
ويتطلب التسويق الناجح للعلاجات الجينية والقائمة علي الخلايا عمليات تصنيع فعاله من حيث التكلفة وقابله للتطوير. تبادل المخزن المؤقت وتركيز المنتج هي مكونات أساسيه لمعظم عمليات التصنيع. ومع ذلك ، في المراحل المبكرة من تطوير المنتج ، غالبا ما يتم تنفيذ هذه الخطوات يدويا. الطرد اليدوية الميتة لتبادل العازلة كثيفه العمالة ومكلفه وغير قابله للتطوير. ويمكن للنظام المؤتمت المغلق ان يزيل هذه الخطوة المضنية بشكل فعال ، ولكن التنفيذ يمكن ان يكون صعبا. هنا ، ونحن وصف جهاز معالجه الخلايا المطورة حديثا التي هي مناسبه لتجهيز الخلايا الصغيرة والمتوسطة الحجم ، ويهدف إلى سد الفجوة بين المعالجة اليدوية والاتمته علي نطاق واسع. يمكن تطبيق هذا البروتوكول بسهوله علي أنواع الخلايا المختلفة والعمليات عن طريق تعديل معدل التدفق وسرعه الطرد. وقد اظهر بروتوكولنا انتعاش الخلايا العالية مع فترات معالجه أقصر بالمقارنة مع العملية اليدوية. كما حافظت الخلايا المستعادة من العملية المؤتمتة علي معدلات انتشارها. يمكن تطبيق الجهاز كمكون وحدات في عمليه تصنيع مغلقه لاستيعاب الخطوات مثل تبادل المخزن المؤقت ، وصياغة الخلية ، والحفظ بالتبريد.
Introduction
وقد تحولت المناظر الطبيعية للطب الحديث بسرعة من خلال التطورات الاخيره في الجينات والعلاجات القائمة علي الخلايا (GCT). باعتبارها واحده من أسرع المجالات نموا في البحوث الانتقالية ، وقطاع GCT يواجه أيضا تحديات فريدة من نوعها وغير مسبوقة. الاضافه إلى النتائج السريرية القوية ، فان عمليات التصنيع الكفؤه والفعالة من حيث التكلفة ضرورية للنجاح التجاري لهذه العملية ، وهو أمر يصعب تحقيقه بشكل خاص في الصناعات التحويلية الصغيرة الحجم1. يتم تضخيم تكلفه الوقت والعمل وضمانات الجودة عندما تنتج كل دفعه من الخلايا فقط جرعات قليله لمريض واحد بدلا من مئات أو آلاف. علي عكس العلاجات الخلوية الخيفيه التي تكون فيها عمليات التصنيع أقرب إلى إنتاج الأجسام المضادة والبروتينات المؤتلفة ، يتم عاده إنتاج العلاجات الذاتية للخلايا كعمليات صغيره الحجم1. كظاهره جديده نسبيا في تصنيع ادويه2، خيارات لمعالجه الخلايا الصغيرة الحجم حاليا محدوده جدا.
تبادل المخزن المؤقت ضروري لتصنيع الخلايا. وهي واحده من العمليات المصب حيث يتم أزاله الخلايا من وسائل الاعلام الثقافية وتتركز للحجز بالتبريد أو التسريب. وفي الوقت الراهن ، غالبا ما يطبق تصنيع الخلايا الصغيرة عمليات مماثله لتلك الموجودة في اعداد البحوث الاكاديميه ويعتمد علي غرف نظيفه متخصصة للمحافظة علي العقم3. العمليات اليدوية المصب غالبا ما تستخدم أجهزه الطرد المركزي العلوية لبيليه وأعاده تعليق الخلايا للحد من حجم وتبادل العازلة. هذه العمليات المفتوحة مكلفه (اي العمل وصيانة الغرف النظيفة) ولها قدره تصنيع محدوده ، والتي ليست مثاليه للإنتاج التجاري2،3.
وقد اقترح تنفيذ الاتمته كحل لتحسين كفاءه التصنيع وتحقيق الإنتاج علي نطاق تجاري2. لا يمكن تحقيق العقم في المنتجات القائمة علي الخلايا من خلال الأساليب التقليدية المستخدمة في البيولوجية ، مثل إشعاع جاما أو الترشيح نهاية المحطة الطرفية. وبدلا من ذلك ، يتم نشر نظام أوتوماتيكي مغلق للحد من مخاطر التلوث والمشغلين الذين يعتمدون علي غرف نظيفه للحفاظ علي العقم4. كما تعالج أتمته العمليات مساله قابليه التحجيم اما بوجود أنظمه متعددة تعمل بالتوازي (التحجيم) أو بزيادة قدره المعالجة لجهاز فردي (توسيع النطاق) ، مما يقلل بدوره من التباين بين المشغلين. وعلاوة علي ذلك ، فان تحليل نمذجة التكلفة للعلاجات الذاتية يوحي بان الاتمته قد تقلل من تكلفه التصنيع5،6. ومع ذلك ، لم يتم العثور علي فائده التكلفة في التجربة السريرية للخلايا الجذعية الذاتية حيث تم استخدام منصة التصنيع الألى7، مما يوحي بان فائده التكلفة من الاتمته قد تعتمد علي عمليه التصنيع الفردية.
هناك استراتيجيات مختلفه في الاتمته التي يمكن إدخالها في عمليه التصنيع القائمة. ويمكن تحقيق ذلك اما عن طريق تنفيذ منصة متكاملة تماما أو سلسله تجهيز تستند إلى وحدات. هناك عده منصات متكاملة بالبالكامل متاحه تجاريا لتصنيع الخلايا الذاتية ، مثل كليمياكس المعجزة (Miltenyi بيوتيك) ، شرنقة (اوكتان التكنولوجيا الحيوية) ، والكم (Terumo BCT). هذه المنصات المتكاملة ، والتي غالبا ما توصف بأنها “GMP في مربع” ، لديها طلبات منخفضه علي البنية التحتية وسهله التشغيل. ومع ذلك ، فان القدرة التصنيعية لاعداد متكامل تماما قد تكون مقيده من قبل الحاضنة الملحقة بالنظام. علي سبيل المثال ، ويقتصر القدرة علي الخياطة معجزه لها 400 مل غرفه8 وخرطوشه الكم لديها مساحة الحد السطحية تعيين إلى 2.1 m2 (ما يعادل 120 T175 قوارير)7، والتي قد لا تكون كافيه للمرضي الذين يحتاجون إلى جرعات اعلي الخلية9،10. بالاضافه إلى ذلك ، معجزه والكم لديها سمه مشتركه التي تحد من استخدامها: الوحدة التشغيلية مشغولة بدفعه واحده من الخلايا طوال فتره توسيع الخلية ، التالي الحد من عدد الدفعات التي يمكن تصنيعها من قبل كل وحده11. نهج وحدات لاتمته هو إنشاء سلسله التصنيع مع وحدات متعددة وحدات التي تحاكي عمليه التصنيع التجاري12,13. هذا النهج ، الذي يفصل جهاز الثقافة من جهاز غسل الخلية ، التالي يمكن تعظيم كفاءه التصنيع. سيكون جهاز تجهيز مثاليه واحده التي هي قابله للتكيف وقابله للتطوير لاحتياجات التصنيع12.
وكان لتكنولوجيا طرد المضادة للتدفق (CFC) ، التي تعود إلى السبعينات ، تاريخ طويل في معالجه الخلايا14. فانه يحقق تركيز الخلية والانفصال عن طريق موازنة قوه الطرد المركزي مع قوه مضاده للتدفق. عاده ، يدخل تعليق الخلية من النهاية الضيقة للغرفة الخلية تحت معدل تدفق ثابت اثناء الخضوع لقوه الطرد المركزي (الشكل 1ا). ويمارس تدفق السائل في الاتجاه المعاكس لقوه الطرد المركزي. ويشار إلى ذلك بالقوة المضادة للتدفق ، التي تشكل تدرجا داخل الغرفة الخلوية. ثم تنخفض قوه التدفق المضاد حيث تتوسع الغرفة الخلوية بعيدا عن طرف غرفه الخلية المخروطية الشكل. الخلايا ذات الكثافة العالية والقطر الأكبر لديها معدل ترسيب اعلي ، التالي فانها تصل إلى قوه التوازن نحو غيض من المخروط علي شكل غرفه الخلية. الجزيئات الصغيرة قد تصل إلى التوازن نحو قاعده الغرفة أو تكون صغيره جدا للاحتفاظ بها في الغرفة سيتم غسلها بعيدا. ومن المعروف في الغالب تكنولوجيا CFC لتطبيقه في معالجه المنتجات الفصاده الدم ، مثل عزل الخلايا الاحاديه لعلاجات الخلايا الجذعية15،16. وفيما يتعلق بالتبادل الاحتياطي ، فان تكنولوجيا مركبات الكربون الكلوريه فلورية لم تطبق الا في الصناعات التحويلية الكبيرة الحجم17 ولم تستخدم بعد في تصنيع العلاجات الخلوية الذاتية علي نطاق أصغر.
ولمعالجه الحاجة إلى جهاز مناسب لتصنيع الخلايا الصغيرة الحجم ، تم مؤخرا تطوير جهاز مركبات الكربون الكلوريه فلورية الألى (انظر جدول المواد) ،18. يستخدم الجهاز الألى لمعالجه الخلايا تقنيه طرد التدفق المضاد لأزاله الحطام الخلوي وتسهيل تبادل المخزن المؤقت. يقوم الجهاز باجراء تبادل المخزن المؤقت مع مجموعه الاستخدام المفرد التي يمكن ان تكون معقمه-متصلة بحقيبة نقل الخلايا ، والتي تسمح بمعالجه الخلايا داخل نظام معقم ومغلق. هنا ، نقوم بالتحقيق في استخدام جهاز طرد مركزي مضاد للتدفق لاجراء تبادل المخزن المؤقت في ثقافات خلايا الثدييات في البروتوكولات المؤتمتة. في هذه الدراسة ، اختبرنا بروتوكول تبادل العازلة باستخدام خلايا Jurkat والخلايا الجذعية اللحمية (MSCs) لنموذج أنواع الخلايا غير الملتصقة والملتصقة ، علي التوالي. خلايا jurkat هي خلايا الخلد التي غالبا ما تستخدم لدراسة ابيضاض الدم الحاد الخلايا التائية19,20. MSCs هي الخلايا الجذعية الكبار التي تم دراستها في التجارب السريرية البشرية لمجموعه واسعه من الامراض9.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول تبادل المخزن المؤقت التلقائي الموصوف بسيط وسهل الاستخدام. ومع ذلك ، هناك بضع خطوات رئيسيه في هذا البروتوكول ذات اهميه حاسمه وتتطلب اهتماما خاصا. في تجربتنا ، عند معالجه الخلايا الكبيرة مثل MSCs (متوسط قطر 10-15 μm) يجب ان تشمل كل تشغيل ما لا يقل عن 1 × 107 خلايا لتحقيق الشفاء الأمثل ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل برنامج دعم الهياكل الاساسيه التشغيلية لحكومة فيكتوريا ، وقسيمة التكنولوجيا الحكومية الفيكتورية التي تقدمها أداره التنمية الاقتصادية والوظائف والنقل والموارد. RL هو المتلقي لزمالة التطوير الوظيفي لمجلس الصحة والبحوث الطبية الوطنية. ال هو المتلقي لجائزه الدراسات العليا الاستراليه.
Materials
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?. BioProcess International. 14 (4), (2016).
- Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. Mapping success for commercial cell therapy manufacturing. BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).
- Heathman, T. R., et al. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges. Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).
- Lipsitz, Y. Y., et al. A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products. Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2. BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).
- Hanley, P. J., et al. Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System. Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).
- Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).
- Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
- Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy – Moving Target for Industry?. Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).
- James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
- Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies. Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).
- Rafiq, Q. A. Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).
- Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE). Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells. Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).
- Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study. Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).
- Whitford, W. G., Subramanian, G. . Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).
- . SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION Available from: https://www.scinogy.com/projects (2019)
- Yu, D., et al. Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule. Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).
- Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways. Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).
- Ling, W., et al. Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment. 암 연구학. 74 (5), 1576-1587 (2014).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Zhu, F., et al. Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products. Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).
- Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch. Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).
- Stroncek, D. F., et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).
- Mfarrej, B., et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).
- Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation. Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn’s disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).
- Lim, R., et al. First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study. Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).
