Automatisering är nyckeln till uppskalning och kostnadshantering i cell tillverkningen. Detta manuskript beskriver användningen av en motströms centrifugalcell process anordning för automatisering av buffertutbytet och cellkoncentrationen steg för småskaliga bio bearbetning.
Framgångsrik kommersialisering av gen-och cellbaserade terapier kräver tillverkningsprocesser som är kostnadseffektiva och skalbara. Buffertutbyte och produktkoncentration är viktiga komponenter för de flesta tillverkningsprocesser. Men i ett tidigt skede av produktutvecklingen utförs dessa steg ofta manuellt. Manuell återvändsgränd centrifugering för buffertutbyte är arbetsintensiva, kostsamma och inte skalbar. Ett slutet automatiserat system kan effektivt eliminera detta mödosamma steg, men genomförandet kan vara utmanande. Här beskriver vi en nyutvecklad cell bearbetningsenhet som lämpar sig för små till medelstora cell bearbetning och syftar till att överbrygga klyftan mellan manuell bearbetning och storskalig automatisering. Detta protokoll kan enkelt appliceras på olika celltyper och processer genom att ändra flödeshastigheten och centrifugeringshastigheten. Vårt protokoll visade hög cell återhämtning med kortare bearbetningstider jämfört med den manuella processen. Celler som återhämtade sig från den automatiserade processen behöll också sin spridnings grad. Enheten kan användas som en modulär komponent i en sluten tillverkningsprocess för att rymma åtgärder som buffertutbyte, cell formulering och frysförvaring.
Den moderna medicinens landskap har omvandlats snabbt genom den senaste tidens utveckling inom gen-och cellbaserade terapier (GCT). Som ett av de snabbast växande områdena inom translationell forskning står även GCT-sektorn inför unika och oöverträffade utmaningar. Förutom robusta kliniska utfall är effektiva och kostnadseffektiva tillverkningsprocesser avgörande för GCT-kommersiell framgång, vilket är särskilt svårt att uppnå i småskalig tillverkning1. Kostnaden för tid, arbete och kvalitet försäkringar förstoras när varje parti av celler endast producerar några doser för en patient i stället för hundratals eller tusentals. Till skillnad från allogena cellterapier där tillverkningsprocesserna mer liknar produktionen av antikroppar och rekombinanta proteiner, är autologt cellterapier vanligtvis produceras som småskaliga operationer1. Som ett relativt nytt fenomen i biofarmaceutisk tillverkning2, alternativ för småskalig cell bearbetning är för närvarande ganska begränsad.
Buffertutbyte är viktigt för cell tillverkning. Det är en av de nedströms processer där celler avlägsnas från odlingsmedier och koncentrerad till frysförvaring eller infusion. För närvarande gäller småskaliga cell tillverkning ofta processer som liknar dem i den akademiska forskningen inställning och förlitar sig på specialiserade rena rum för att upprätthålla sterilitet3. Manuella nedströms processer använder ofta bänk centrifuger till pellets och Omsuspendera celler för volymreduktion och buffertutbyte. Dessa öppna processer är kostsamma (dvs. arbetskraft och rent rum underhåll) och har begränsad tillverkningskapacitet, som inte är idealiska för kommersiell produktion2,3.
Implementering av Automation har föreslagits som en lösning för att förbättra tillverknings effektiviteten och uppnå kommersiell skala produktioner2. Sterilitet kan inte uppnås i cellbaserade produkter genom traditionella metoder som används för biologiska ämnen, såsom Gammabestrålning eller terminal filtrering. Istället används ett automatiserat slutet system för att minska riskerna för kontaminering och operatörer som förlitar sig på rena rum för att bibehålla sterilitet4. Process Automation löser också problemet med skalbarhet genom att antingen ha flera system som körs parallellt (skala ut) eller öka bearbetningskapaciteten för en enskild enhet (skala upp), vilket i sin tur minimerar variationen mellan operatorer. Dessutom föreslår kostnads modellering analys av autolodiga terapier att automatisering kan minska tillverkningskostnaden5,6. Emellertid, ingen kostnadsfördel hittades i en autolog stamcells klinisk prövning där en automatiserad tillverknings plattform användes7, vilket tyder på att kostnaden för automatisering kan bero på den enskilda tillverkningsprocessen.
Det finns olika strategier där automatisering kan introduceras i en befintlig tillverkningsprocess. Detta kan åstadkommas antingen genom att implementera en helt integrerad plattform eller en modulbaserad bearbetningskedja. Det finns flera helt integrerade plattformar kommersiellt tillgängliga för autolog cell tillverkning, såsom CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech), och Quantum (Terumo BCT). Dessa integrerade plattformar, som ofta beskrivs som “GMP-in-a-Box”, har låga krav på infrastruktur och är lätta att använda. Tillverkningskapaciteten hos en helt integrerad installation kan dock begränsas av den inkubator som är knuten till systemet. Till exempel, den odlingskapacitet Prodigy är begränsad till sin 400 ml kammare8 och Quantum patronen har en begränsande yta inställd på 2,1 m2 (motsvarande 120 T175 flaskor)7, som kanske inte är tillräckligt för patienter som kräver högre cell doser9,10. Dessutom har Prodigy och Quantum ett gemensamt attribut som begränsar deras användning: den operativa enheten upptas av ett enda parti celler under hela cell expansions perioden, vilket begränsar antalet partier som kan tillverkas av varje enhet11. Den modulära metoden för automatisering är att skapa en tillverkningskedja med flera modulära enheter som simulerar den kommersiella tillverkningsprocessen12,13. Denna metod, som separerar kultur enheten från cell tvätt anordningen, kan därmed maximera tillverknings effektiviteten. En idealisk bearbetningsenhet skulle vara en som är anpassningsbar och skalbar till tillverkningsbehov12.
Counterflow centrifugering (CFC) teknik, som går tillbaka till 1970-talet, har haft en lång historia i cell bearbetning14. Den uppnår cell koncentration och separation genom att balansera centrifugalkraften med en motflödeskraft. Typiskt, en cellsuspension in från den smala änden av en cell kammare under en konstant flöde medan utsätts för en centrifugalkraft (figur 1a). Flödet av vätskan utövas i motsatt riktning till centrifugalkraften. Detta kallas för motflödeskraften, som bildar en gradient i cell kammaren. Motflödeskraften minskar sedan när cell kammaren är på avstånd från spetsen på den konformade cell kammaren. Celler med högre densitet och större diameter har högre sedimenteringshastighet, och därmed når de kraftbalansen mot spetsen av den konformade cell kammaren. Mindre partiklar kan nå jämvikt mot botten av kammaren eller vara för små för att behållas i kammaren och kommer att tvättas bort. CFC-tekniken är mest känd för sin tillämpning vid bearbetning av blod aferes produkter, såsom isolerar monocyter för dendritiska cellterapier15,16. När det gäller buffertutbyte har CFC-tekniken endast tillämpats i storskalig tillverkning17 och har ännu inte använts för den småskaliga tillverkningen av autologt cellterapier.
För att tillgodose behovet av en lämplig anordning för småskalig cell tillverkning, en automatiserad CFC-apparat (se tabell över material), utvecklades nyligen18. Den automatiserade cell bearbetning enheten använder motströms centrifugering teknik för att ta bort cell skräp och underlätta buffertutbyte. Enheten utför buffertutbyte med ett engångskit som kan vara sterilt-anslutet till en cell överförings påse, vilket gör att cellerna kan bearbetas i ett sterilt, slutet system. Här undersöker vi användningen av en motströms centrifugalanordning för att utföra buffertutbyte i däggdjurscell kulturer i automatiserade protokoll. I denna studie, vi testade protokollet buffer Exchange med Jurkat celler och mesenkymala stromaceller (MSCs) till modell nonadherent och anhängare celltyper, respektive. Jurkat celler är förevigade t-celler som ofta används för studier av akut t-cellsleukemi19,20. MSCs är vuxna stamceller som har studerats i kliniska prövningar för ett brett spektrum av sjukdomar9.
Det automatiserade buffertutbytes protokollet som beskrivs är enkelt och användarvänligt. Det finns dock några viktiga steg i detta protokoll som är kritiska och som kräver särskild uppmärksamhet. Enligt vår erfarenhet, vid bearbetning av större celler såsom MSCs (genomsnittlig diameter 10-15 μm) varje körning bör omfatta minst 1 x 107 celler för att uppnå optimal cell återhämtning (figur 4B). Bearbetning av mindre celler, såsom Jurkat celler (g…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av den viktorianska regeringens program för drift infrastrukturstöd, och den viktorianska regeringens teknik kupong som tillhandahålls av Institutionen för ekonomisk utveckling, jobb, transport och resurser. RL är mottagare av en nationell hälso-och medicinsk forskning rådets karriärutveckling Fellowship. AL är mottagare av en australisk doktorand utmärkelse.
20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 |
20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 |
4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g |
500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 |
Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 |
Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A |
Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 |
Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 |
Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB |
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 |
EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 |
Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C |
Luer (female) fittings | CPC | LF41 |
PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A |
Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A |
Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 |
Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A |
Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A |
RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 |
Surgical scissors | ProSciTech | 420SS |
Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g |
Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 |
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |