Automatiserat Counterflow Centrifugalsystem för småskaliga cell bearbetning

Summary

Automatisering är nyckeln till uppskalning och kostnadshantering i cell tillverkningen. Detta manuskript beskriver användningen av en motströms centrifugalcell process anordning för automatisering av buffertutbytet och cellkoncentrationen steg för småskaliga bio bearbetning.

Abstract

Framgångsrik kommersialisering av gen-och cellbaserade terapier kräver tillverkningsprocesser som är kostnadseffektiva och skalbara. Buffertutbyte och produktkoncentration är viktiga komponenter för de flesta tillverkningsprocesser. Men i ett tidigt skede av produktutvecklingen utförs dessa steg ofta manuellt. Manuell återvändsgränd centrifugering för buffertutbyte är arbetsintensiva, kostsamma och inte skalbar. Ett slutet automatiserat system kan effektivt eliminera detta mödosamma steg, men genomförandet kan vara utmanande. Här beskriver vi en nyutvecklad cell bearbetningsenhet som lämpar sig för små till medelstora cell bearbetning och syftar till att överbrygga klyftan mellan manuell bearbetning och storskalig automatisering. Detta protokoll kan enkelt appliceras på olika celltyper och processer genom att ändra flödeshastigheten och centrifugeringshastigheten. Vårt protokoll visade hög cell återhämtning med kortare bearbetningstider jämfört med den manuella processen. Celler som återhämtade sig från den automatiserade processen behöll också sin spridnings grad. Enheten kan användas som en modulär komponent i en sluten tillverkningsprocess för att rymma åtgärder som buffertutbyte, cell formulering och frysförvaring.

Introduction

Den moderna medicinens landskap har omvandlats snabbt genom den senaste tidens utveckling inom gen-och cellbaserade terapier (GCT). Som ett av de snabbast växande områdena inom translationell forskning står även GCT-sektorn inför unika och oöverträffade utmaningar. Förutom robusta kliniska utfall är effektiva och kostnadseffektiva tillverkningsprocesser avgörande för GCT-kommersiell framgång, vilket är särskilt svårt att uppnå i småskalig tillverkning¹. Kostnaden för tid, arbete och kvalitet försäkringar förstoras när varje parti av celler endast producerar några doser för en patient i stället för hundratals eller tusentals. Till skillnad från allogena cellterapier där tillverkningsprocesserna mer liknar produktionen av antikroppar och rekombinanta proteiner, är autologt cellterapier vanligtvis produceras som småskaliga operationer¹. Som ett relativt nytt fenomen i biofarmaceutisk tillverkning², alternativ för småskalig cell bearbetning är för närvarande ganska begränsad.

Buffertutbyte är viktigt för cell tillverkning. Det är en av de nedströms processer där celler avlägsnas från odlingsmedier och koncentrerad till frysförvaring eller infusion. För närvarande gäller småskaliga cell tillverkning ofta processer som liknar dem i den akademiska forskningen inställning och förlitar sig på specialiserade rena rum för att upprätthålla sterilitet³. Manuella nedströms processer använder ofta bänk centrifuger till pellets och Omsuspendera celler för volymreduktion och buffertutbyte. Dessa öppna processer är kostsamma (dvs. arbetskraft och rent rum underhåll) och har begränsad tillverkningskapacitet, som inte är idealiska för kommersiell produktion^2,3.

Implementering av Automation har föreslagits som en lösning för att förbättra tillverknings effektiviteten och uppnå kommersiell skala produktioner². Sterilitet kan inte uppnås i cellbaserade produkter genom traditionella metoder som används för biologiska ämnen, såsom Gammabestrålning eller terminal filtrering. Istället används ett automatiserat slutet system för att minska riskerna för kontaminering och operatörer som förlitar sig på rena rum för att bibehålla sterilitet⁴. Process Automation löser också problemet med skalbarhet genom att antingen ha flera system som körs parallellt (skala ut) eller öka bearbetningskapaciteten för en enskild enhet (skala upp), vilket i sin tur minimerar variationen mellan operatorer. Dessutom föreslår kostnads modellering analys av autolodiga terapier att automatisering kan minska tillverkningskostnaden^5,6. Emellertid, ingen kostnadsfördel hittades i en autolog stamcells klinisk prövning där en automatiserad tillverknings plattform användes⁷, vilket tyder på att kostnaden för automatisering kan bero på den enskilda tillverkningsprocessen.

Det finns olika strategier där automatisering kan introduceras i en befintlig tillverkningsprocess. Detta kan åstadkommas antingen genom att implementera en helt integrerad plattform eller en modulbaserad bearbetningskedja. Det finns flera helt integrerade plattformar kommersiellt tillgängliga för autolog cell tillverkning, såsom CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech), och Quantum (Terumo BCT). Dessa integrerade plattformar, som ofta beskrivs som “GMP-in-a-Box”, har låga krav på infrastruktur och är lätta att använda. Tillverkningskapaciteten hos en helt integrerad installation kan dock begränsas av den inkubator som är knuten till systemet. Till exempel, den odlingskapacitet Prodigy är begränsad till sin 400 ml kammare⁸ och Quantum patronen har en begränsande yta inställd på 2,1 m² (motsvarande 120 T175 flaskor)⁷, som kanske inte är tillräckligt för patienter som kräver högre cell doser^9,10. Dessutom har Prodigy och Quantum ett gemensamt attribut som begränsar deras användning: den operativa enheten upptas av ett enda parti celler under hela cell expansions perioden, vilket begränsar antalet partier som kan tillverkas av varje enhet¹¹. Den modulära metoden för automatisering är att skapa en tillverkningskedja med flera modulära enheter som simulerar den kommersiella tillverkningsprocessen^12,13. Denna metod, som separerar kultur enheten från cell tvätt anordningen, kan därmed maximera tillverknings effektiviteten. En idealisk bearbetningsenhet skulle vara en som är anpassningsbar och skalbar till tillverkningsbehov¹².

Counterflow centrifugering (CFC) teknik, som går tillbaka till 1970-talet, har haft en lång historia i cell bearbetning¹⁴. Den uppnår cell koncentration och separation genom att balansera centrifugalkraften med en motflödeskraft. Typiskt, en cellsuspension in från den smala änden av en cell kammare under en konstant flöde medan utsätts för en centrifugalkraft (figur 1a). Flödet av vätskan utövas i motsatt riktning till centrifugalkraften. Detta kallas för motflödeskraften, som bildar en gradient i cell kammaren. Motflödeskraften minskar sedan när cell kammaren är på avstånd från spetsen på den konformade cell kammaren. Celler med högre densitet och större diameter har högre sedimenteringshastighet, och därmed når de kraftbalansen mot spetsen av den konformade cell kammaren. Mindre partiklar kan nå jämvikt mot botten av kammaren eller vara för små för att behållas i kammaren och kommer att tvättas bort. CFC-tekniken är mest känd för sin tillämpning vid bearbetning av blod aferes produkter, såsom isolerar monocyter för dendritiska cellterapier^15,16. När det gäller buffertutbyte har CFC-tekniken endast tillämpats i storskalig tillverkning¹⁷ och har ännu inte använts för den småskaliga tillverkningen av autologt cellterapier.

För att tillgodose behovet av en lämplig anordning för småskalig cell tillverkning, en automatiserad CFC-apparat (se tabell över material), utvecklades nyligen¹⁸. Den automatiserade cell bearbetning enheten använder motströms centrifugering teknik för att ta bort cell skräp och underlätta buffertutbyte. Enheten utför buffertutbyte med ett engångskit som kan vara sterilt-anslutet till en cell överförings påse, vilket gör att cellerna kan bearbetas i ett sterilt, slutet system. Här undersöker vi användningen av en motströms centrifugalanordning för att utföra buffertutbyte i däggdjurscell kulturer i automatiserade protokoll. I denna studie, vi testade protokollet buffer Exchange med Jurkat celler och mesenkymala stromaceller (MSCs) till modell nonadherent och anhängare celltyper, respektive. Jurkat celler är förevigade t-celler som ofta används för studier av akut t-cellsleukemi^19,20. MSCs är vuxna stamceller som har studerats i kliniska prövningar för ett brett spektrum av sjukdomar⁹.

Protocol

1. beredning av reagenser och celler för buffertutbyte Förbered buffertar (se tabell över material) i en klass 2 laminärt flöde huva. Med hjälp av en spruta och nål montering, ta bort 50 mL saltlösning från en 500 mL koksalt påse. Ersätt detta med 50 mL av 20% humant serumalbumin (HSA) för att göra 2% HSA i saltlösning, som kommer att fungera som tvättbuffert. Ta bort cellerna från odlings kärlen och utför ett cellantal för att bestämma startcellskvantiteten och l?…

Representative Results

I detta protokoll använde vi Jurkat-celler och MSCs som representativa exempel för att demonstrera den automatiserade buffertutbytesprocessen. Under processen delade Jurkat-celler och MSCs samma bearbetningssteg med skillnader i centrifugalkraft och pumphastighet som styr flödeshastigheten (tabell 1). Figur 2 visar representativa bilder tagna av kameran på hur den fluidiserade cellbädden kan visas under buffertutbytes processen. Typiskt, fluidiserad bädd cell sängen k…

Discussion

Det automatiserade buffertutbytes protokollet som beskrivs är enkelt och användarvänligt. Det finns dock några viktiga steg i detta protokoll som är kritiska och som kräver särskild uppmärksamhet. Enligt vår erfarenhet, vid bearbetning av större celler såsom MSCs (genomsnittlig diameter 10-15 μm) varje körning bör omfatta minst 1 x 10⁷ celler för att uppnå optimal cell återhämtning (figur 4B). Bearbetning av mindre celler, såsom Jurkat celler (g…

Materials

20 ml Luer lock syringes	BD	302830
20% Human serum albumin (HSA)	CSL Behring	AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma-Aldrich	156477-25g
500ml IV saline bag	Fresenius Kabi	K690521
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240112
Automated cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	N/A
Cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Cell stimulation cocktail (500x)	Thermo Fisher Scientific	00-4970-93
Cell transfer bags	Terumo	T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM: F12 media	Thermo Fisher Scientific	11320082
EnVision plate Reader	Perkin Elmer	N/A
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit	Perkin Elmer	Al221C
Luer (female) fittings	CPC	LF41
PC laptop or PC tablet device	ASUS	N/A
Plate reader (SpectraMax i3)	Molecular Device	N/A
Recombinant Human IFN-γ	PeproTech	300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing device	Scinogy	N/A
Rotea single-use processing kit	Scinogy	N/A
RPMI media	Thermo Fisher Scientific	11875119
Surgical scissors	ProSciTech	420SS
Trichloroacetic acide	Sigma-Aldrich	T6399-250g
Trypan Blue stain	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher Scientific	12604013