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방법 논문

인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

10.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60434

⸱

2019년 12월 13일

 ,  ,  ,  ,  , 

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

세포외 세포외 매트릭스(dECM)는 엔지니어링된 구조에서 표적 조직의 고유 기능을 재량화하기 위한 적절한 미세 환경 단서를 제공할 수 있습니다. 이 기사는 췌장 조직의 탈세포화, 췌장 조직 유래 dECM 바이오 잉크의 평가 및 생체 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구성의 생성을위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

췌도의 이식은 저혈당증 및 이차 합병증을 동반한 타입-1 당뇨병 때문에 손해를 입는 환자를 위한 유망한 처리입니다. 그러나, 섬 이식은 여전히 가난한 섬 생착 및 적대적인 환경으로 인해 이식 된 작은 섬의 낮은 생존가능성과 같은 몇 가지 제한사항이 있습니다. 또한, 인간 만능 줄기세포로부터 분화된 인슐린 생성 세포는 혈당 수준을 조절할 수 있는 충분한 호르몬을 분비하는 능력이 제한되어 있다; 따라서 적절한 미세 환경 단서로 세포를 배양하여 성숙을 개선하는 것이 매우 필요합니다. 이 기사에서는 췌도의 포도당 민감도를 증가시킬 수있는 유익한 미세 환경을 제공하기 위해 췌장 조직 유래 탈세포화 세포 질매트릭스 (pdECM) bioink를 준비하기위한 프로토콜을 설명하고 설명합니다. 3D 췌장 조직 생성 과정은 마이크로 압출 기반의 바이오 프린팅 기술을 사용하여 구성됩니다.

서론

최근 췌도 이식은 제1형 당뇨병 환자에게 유망한 치료법으로 여겨지고 있다. 절차의 상대적 안전성과 최소 침습성은이 치료의 큰장점입니다 1. 그러나, 그것은 고립 된 섬과 면역 억제 약물의 부작용의 낮은 성공률과 같은 몇 가지 한계가 있다. 더욱이, 적대적인 환경으로 인해 이식 후 이식 후 이식된 작은 섬의 수는 꾸준히 감소한다2. 이러한 어려움을 극복하기 위해 알긴산, 콜라겐, 폴리(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 다양한 생체 적합성 물질이 췌도 이식에 적용되어 왔다.

3D 세포 프린팅 기술은 큰 잠재력과 높은 성능으로 인해 조직 공학에서 부상하고 있습니다. 말할 필요도 없이, bioinks는 인쇄된 조직 구조물에 있는 세포 프로세스의 개선을 가능하게 하는 적당한 미세 환경을 제공하고 가능하게 하기 위한 중요한 분대로 알려져 있습니다. 피브린, 알긴산 및 콜라겐과 같은 전단 숱이 많은 하이드로겔은 바이오잉크로 널리 사용됩니다. 그러나, 이들 물질은 네이티브 조직에서 세포외 매트릭스(ECM)에 비해 구조적, 화학적, 생물학적, 및 기계적 복잡성의 부족을 보여준다3.....

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프로토콜

돼지 췌장 조직은 지역 도축장에서 수집되었다. 동물실험은 한국서울병원 동물보호위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 조직 탈세포화

  1. 탈세포화를 위한 솔루션을 준비합니다.
    참고: 모든 용액 제제에 사용되는 1x 인산염 완충식염수(PBS)는 증류수를 10x PBS에 첨가하여 희석됩니다.
    1. 1% Triton-X 100 용액의 경우, 100% 트리톤-X 100 용액의 100mL를 100% 트리톤-X 100 용액을 100% 트리톤-X 100 용액의 100mL을 100mL의 100mL용으로 용해하여 150rpm의 자석 교반 바를 사용하여 100mL의 100mL를 100% 트리톤-X 100 mL의 100mL 및 10% 트리톤-X 100mL의 40mL로 100mL, 100% 트리톤-X 100mL용으로 100mL, 100mL의 트리톤-X 100mL용을 100mL로 용해 PBS는 사용하기 직전에 준비되었습니다.
      참고 : 10 % Triton-X 100 용액은 필요할 때까지 실온에서 보관 할 수 있습니다.
    2. 0.1% 퍼라세산 용액의 경우, 사용 직전에 증류수 368.7 mL로 70% 에탄올의 22.8 mL로 4.7% peracetic acid의 8.5 mL를 희석하십시오.

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결과

췌장 조직의 세포화
우리는 3D 생체 인쇄 조직 구조에서 췌도의 기능을 향상시키기위한 췌장 조직 특이적 미세 환경을 제공하기 위해 pdECM bioink를 준비하는 과정을 개발했습니다(그림 2A). 탈세포화 과정 후, dsDNA의 97.3%가 제거되었고 콜라겐 및 GAGs와 같은 대표적인 ECM 성분은 각각 원어민 췌장 조직에 비해 1278.1% 및 96.9%로 유지되었다(도2B).

바이오잉크 제제
프린팅 공정에 pdECM을 적용하기 위해, pdECM 분말을 펩신으로 약한 산으로 용해시키고 10 M NaOH 용액을 사용하여 중화.......

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토론

이 프로토콜은 pdECM 바이오 잉크의 개발및 3D 세포 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구성의 제조를 설명했다. 3D 엔지니어링 조직 구성에서 표적 조직의 미세 환경을 재환기시키기 위해 bioink의 선택은 매우 중요합니다. 이전 연구에서, 우리는 조직 특이적 dECM 바이오잉크가 줄기세포 분화 및 증식을 촉진하는 데 유익하다는 것을검증했다 10. 합성 중합체에 비해, dECM은 조직 특이적 조성물 및아키텍처(11)때문에 세포 유리한 환경으로서 작용할 수 있다. 따라서, 탈세포화 과정은 dECM에서 주요 성분의 높은 체류를 진지하게 고려되어야 한다.

췌장 조직의 탈세포화를 위한 상이한 세제의 선택은 잔류 ECM성분(12)을변화시다. 탈세포화 과정에서, 우리는 나트륨 도데실 황산염 (SDS)의 사용이 ECM 단백질(.......

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감사의 글

이 연구는 한국 정부(MSIT)(2017M3A9C6032067)와 "ICT 융합 창의프로그램"(IITP-2019-2011-1-00783)의 지원을 받아 국립연구재단(NRF)의 바이오 및 의료기술 개발 프로그램을 지원받았습니다. IITP(정보통신기술기획평가연구원)의 감독을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
생물 안전 작업대CRYSTEPURICUBE 1200
Deep FreezerThermo Scientific Forma957
디지털 오비탈 쉐이커DAIHAN ScientificDH.
건조 오븐DAIHAN ScientificWON-155
동결 건조기LABCONCO7670540
냉장고SANSUNGCRFD-1141
강판ABM1415605793
도립 현미경LeicaDMi1
마이크로 원심분리기CRYSTEPURISPIN 17R
마이크로플레이트 리더Thermo Fisher ScientificMultiskan GO
Mini 원심분리기DAIHAN ScientificCF-5
다중 핫플레이트 교반기DAIHAN ScientificSMHS-6
나노드롭Thermo Fisher ScientificND-LITE-PR
pH 탁상용 측정기Thermo Fisher ScientificSTARA2110
레오미터TA InstrumentDiscovery HR-2
Vortex MixerDAIHAN ScientificVM-10
Cirurgical Instruments
Operating ScissorsHiroseHC.13-122
ForcepKorea Ace ScientificHC.203-30
Materials
1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브AxygenMCT-175-C
10ml 유리 바이알ScilabSL. VI1243
40 &마이크로; m 셀 스트레이너Falcon352340
5L 비커동성 과학SDS 2400
50mL cornical tubeFalcon352070
500mL 비커한국 에이스 사이언티픽KA.23-08
500mL 보틀탑 진공 필터Corning431118
500mL 플라스틱 용기LOCK& LOCKINL301
96웰 플레이트팔콘353072
알루미늄 호일대교
김와이프 Kimtech
마그네틱 바한국 에이스 사이언티픽BA.37110-0003
박격포 및 유봉DAIHAN ScientificSC. MG100
멀티 채널 피펫터Eppendorf4982000314
Petri DishSPL10100
pH 지시자 스트립Sigma-Aldrich1095350001
체 필터 메쉬DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbsHycloneSH30258.01
4.7% 과아세트산오메가팜
70% 에탄올SAMCHUN CHEMICALSE0220 SAM
증류수
IPASAMCHUN CHEMICALS삼춘 I0348
Triton-X 100BiosesangT1020
Biochemical assay
1,9-디메틸-메틸렌 블루 아연 클로라이드 이중 염시그마-알드리치341088
10 N NaOHBiosesangS2018
클로라민 T시그마-알드리치857319
콘드로이틴 설페이트 A시그마-알드리치C4384
구연산Supelco46933
시스테인-HCl, 시그마-알드리치C1276
빙초산메록100063
글리신시그마-알드리치, 410225
HCl, 시그마-알드리치H1758
Na2-EDTA, 시그마-알드리치E5134
NaCl삼춘화학제품, S2097
파파인시그마-알드리치p4762
P-DAB시그마-알드리치D2004
과염소산시그마-알드리치311421
아세트산나트륨시그마-알드리치S5636
수산화나트륨수펠코SX0607N
인산나트륨(일염기성)시그마-알드리치RDD007
톨루엔Sigma-Aldrich244511
Bioink
Charicterized FBSHycloneSH30084.03
페니실린-스트렙토마이신Thermo Fisher Scientific15140122
PepsinSigma-AldrichP7215
로즈 벵골Sigma-Aldrich198250
RPMI-1640 매체Thermo Fisher Scientific11875093
Trypan Blue 솔루션Sigma-AldrichT8154
WSO04010, , , , , , , , ,

참고문헌

  1. Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268(2017).
  2. Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeu....

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