Vorbereitung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Ovarialgeweben für die quantitative Proteomik-Analyse
Summary
Dieser Artikel stellt ein Protokoll der Differentialgeschwindigkeitszentrifugation in Kombination mit Dichtegradientenzentrifugation vor, um Mitochondrien von menschlichen Eierstockkrebsgeweben zu trennen und Eierstockgewebe für die quantitative Proteomik-Analyse zu kontrollieren, eine hochwertige mitochondriale Probe und eine quantitative Proteomikanalyse mit hohem Durchsatz und hoher Reproduzierbarkeit eines humanen Ovarialkarzinoms mitochondrialem Proteom.
Abstract
Eierstockkrebs ist ein häufiger gynäkologischer Krebs mit hoher Sterblichkeit, aber unklarem molekularen Mechanismus. Die meisten Eierstockkrebserkrankungen werden im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, was die Therapie ernsthaft behindert. Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen menschlicher Eierstockkrebserkrankungen, und Mitochondrien sind die Zentren des Energiestoffwechsels, der Zellsignalisierung und des oxidativen Stresses. Tiefe Einblicke in die Veränderungen des mitochondrialen Proteoms bei Eierstockkrebs im Vergleich zur Kontrolle des Eierstockgewebes werden ein vertieftes Verständnis der molekularen Mechanismen von Eierstockkrebs und die Entdeckung wirksamer und zuverlässiger Biomarker und therapeutischer Ziele bewirken. Eine effektive mitochondriale Präparationsmethode in Verbindung mit einem isobarischen Tag für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) quantitative Proteomik werden hier vorgestellt, um menschlichen Eierstockkrebs zu analysieren und mitochondriale Proteome zu kontrollieren, einschließlich Differentialgeschwindigkeitszentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation, Qualitätsbewertung von mitochondrialen Proben, Proteinverdauung mit Trypsin, iTRAQ-Kennzeichnung, starke Kationenaustauschfraktionierung (SCX), Flüssigkeitschromatographie (LC), Tandem-Massenspektrometrie (MS/ MS), Datenbankanalyse und quantitative Analyse von mitochondrialen Proteinen. Viele Proteine wurden erfolgreich identifiziert, um die Abdeckung des humanen Ovarialkarzinoms zu maximieren und das differenziell exprimierte mitochondriale Proteinprofil bei menschlichen Eierstockkrebs zu erreichen.
Introduction
Eierstockkrebs ist ein häufiger gynäkologischer Krebs mit hoher Sterblichkeit, aber unklarem molekularen Mechanismus1,2. Die meisten Eierstockkrebserkrankungen werden im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, was die Therapie ernsthaft behindert. Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen von menschlichen Eierstockkrebs, und Mitochondrien sind die Zentren des Energiestoffwechsels, Zellsignalisierung, und oxidativen Stress3,4,5,6,7. Tiefe Einblicke in die Veränderungen des mitochondrialen Proteoms bei Eierstockkrebs im Vergleich zur Kontrolle des Eierstockgewebes werden ein vertieftes Verständnis der molekularen Mechanismen von Eierstockkrebs und die Entdeckung wirksamer und zuverlässiger Biomarker und therapeutischer Ziele bewirken. Mitochondrialer Stoffwechsel wurde vorgeschlagen und als Ziel für die Krebstherapie anerkannt, und antimitochondriale Therapie könnte letztlich sehr vorteilhaft für die Verhinderung des Wiederauftretens und Metastasierung von Krebs8sein. Individuelle metabolische Profilerstellung wird auch bereits als nützliches Werkzeug für Krebsschichtung und Vorhersagestrategien9,10praktiziert.
Das langfristige Ziel dieser Forschung ist die Entwicklung und Verwendung einer quantitativen mitochondrialen Proteomik-Methode zur Untersuchung von Eierstockkrebs zur Klärung von mitochondrialen Proteomveränderungen zwischen Eierstockkrebs und Kontrolle von Eierstockgeweben und deren molekularen Netzwerkveränderungen aus einem systematischen Multiomics-Winkel11,12, was zur Entdeckung von mitochondrienzielorientierten molekularen Biomarkern13 zur Klärung der molekularen Mechanismen von und personalisierte Behandlung von Eierstockkrebspatienten. Isobarische Tags für die relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) Kennzeichnung3,4 sind eine effektive Methode, um die mitochondrialen Proteinveränderungen zu quantifizieren. Die Herstellung hochwertiger mitochondrialer Proben aus humanem Eierstockkrebs und die Kontrolle von Eierstockgeweben sind die Voraussetzung für die quantitative iTRAQ-Analyse von mitochondrialen Proteomen3. Mitochondriale Präparat in Verbindung mit iTRAQ quantitative proteomics wurde erfolgreich in langfristigen Forschungsprogrammen über den menschlichen Eierstockkrebs mitochondrialen Proteom verwendet, einschließlich der Einrichtung von mitochondrialen Proteom Referenzkarten3, die Analyse von differenziell exprimierten mitochondrialen Profilen4,14 und post-translational Modifikationen, einschließlich Phosphorylierung, die bereits zur Entdeckung eines wichtigen Signalwegs geführt hat Netzwerkveränderungen bei menschlichen Eierstockkrebs5, einschließlich Veränderungen im Energiestoffwechsel4, Fettstoffwechsel, und Mitophagie-Signalweg-Systeme3.
Frühere Studien haben herausgefunden, dass Differentialgeschwindigkeitszentrifugation in Kombination mit Dichtegradientenzentrifugation eine effektive Methode ist, um Mitochondrien von menschlichem Eierstockkrebs zu isolieren und zu reinigen und Eierstockgewebe3,4,5,14zu kontrollieren. Die iTRAQ-Etikettierung in Verbindung mit starker Kationenaustausch (SCX)-Flüssigchromatographie (LC)-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) ist die Schlüsseltechnik, um die Proteine aus den vorbereiteten mitochondrialen Proben zu erkennen, zu identifizieren und zu quantifizieren.
Hier werden detaillierte Protokolle für die mitochondriale Präparation in Verbindung mit der quantitativen iTRAQ-Proteomik beschrieben. Diese wurden erfolgreich bei der Analyse von humanen Eierstockkrebsgewebe mitochondrialen Proteomen eingesetzt. Die Protokolle umfassen die Vorbereitung von Proben, Differentialgeschwindigkeitszentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation, Qualitätsbewertung von mitochondrialen Proben, Proteinverdauung mit Trypsin, iTRAQ-Kennzeichnung, SCX-Fraktionierung, LC, MS/MS, Datenbanksuche und quantitative Analyse von mitochondrialen Proteinen. Darüber hinaus übersetzt dieses Protokoll leicht, um andere menschliche Gewebe mitochondriale Proteome zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen von Eierstockkrebs. Die Herstellung hochwertiger mitochondrialer Proben aus menschlichem Eierstockkrebs und Kontrollgewebe nützen dem tiefen Verständnis der mitochondrialen Funktion bei Eierstockkrebspathogenese und mitochondrialen molekularen Netzwerkveränderungen und helfen dabei, den molekularen Mechanismus für die spätere Entdeckung der Zieltherapie und wirksamer Biomarker auf Basis von Mitochondrien4,5<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Hunan Provincial Hundred Talent Plan (zu X.Z.), die Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (to XZ), die National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 und 81272798 to XZ), die Stipendien aus China “863” Plan Projekt (Grant-Nr. 2014AA020610-1 bis XZ) und die Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 14JJ7008 to XZ). X.Z. konzipierte das Konzept für das vorliegende Manuskript, erhielt die iTRAQ quantitativen Proteomik-Daten von Mitochondrienproben, schrieb und überarbeitete das Manuskript, koordinierte die entsprechende Arbeit und war für die finanzielle Unterstützung und die entsprechende Arbeit. H.L. bereitete Mitochondrienproben her. S.Q. nahm an Teilarbeiten teil. X.H.Z nahm am Schreiben und Bearbeiten der englischen Sprache teil. N.L. analysierte die iTRAQ Proteomics-Daten. Alle Autoren stimmten dem endgültigen Manuskript zu.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
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