卵巣癌組織からのミトコンドリアの調製と定量プロテオミクス解析のためのコントロール卵巣組織
Summary
本稿では、ヒト卵巣癌組織からミトコンドリアを分離し、定量プロテオミクス解析のために卵巣組織を制御する密度勾配遠心分離と組み合わせた微分速度遠心分離のプロトコルを提示し、ヒト卵巣癌ミトコンドリアプロテオメの高品質なミトコンドリアサンプルと高スループットで再現性の高い定量プロテオミクス解析を行う。
Abstract
卵巣癌は、死亡率は高いが分子機構が不明確な一般的な婦人科癌である。ほとんどの卵巣癌は進行期に診断され、治療を深刻に妨げる。ミトコンドリアの変化はヒトの卵巣癌の特徴であり、ミトコンドリアはエネルギー代謝、細胞シグナル伝達、酸化ストレスの中心である。対照卵巣組織と比較した卵巣癌におけるミトコンドリアプロテオームの変化に関する深い洞察は、卵巣癌の分子機構の深い理解と、効果的で信頼性の高いバイオマーカーおよび治療標的の発見に役立つ。ヒト卵巣癌を解析し、ミトコンドリアプロテオメを制御するために、相対および絶対定量(iTRAQ)定量のための等圧タグと組み合わせた有効なミトコンドリア調製方法がここに提示され、 差動速度遠心分離、密度勾配遠心分離、ミトコンドリアサンプルの品質評価、トリプシンによるタンパク質消化、iTRAQ標識、強カチ交換分画(SCX)、液体クロマトグラフィー(LC)、タンデム質量分析(MS/MS)、データベース分析、ミトコンドリアタンパク質の定量分析。多くのタンパク質は、ヒト卵巣癌ミトコンドリアプロテオームのカバレッジを最大化し、ヒト卵巣癌における微分発現ミトコンドリアタンパク質プロファイルを達成するために正常に同定された。
Introduction
卵巣癌は、死亡率は高いが分子機構が不明確な一般的な婦人科癌である1、2.卵巣癌のほとんどは進行期に診断され、治療を深刻に妨げる。ミトコンドリアの変化はヒト卵巣癌の特徴であり、ミトコンドリアはエネルギー代謝、細胞シグナル伝達、および酸化ストレス3、4、5、6、7の中心である。対照卵巣組織と比較した卵巣癌におけるミトコンドリアプロテオームの変化に関する深い洞察は、卵巣癌の分子機構の深い理解と、効果的で信頼性の高いバイオマーカーおよび治療標的の発見に役立つ。ミトコンドリア代謝が提案され、癌治療の標的として認識されており、抗ミトコンドリア療法は最終的には癌8の再発および転移を予防するために非常に有益であり得る。個々の代謝プロファイリングは、癌階層化および予測戦略9、10のための有用なツールとしても既に実施されている。
本研究の長期的な目標は、卵巣癌と対照卵巣組織との間のミトコンドリアプロテオム改変を解明するための卵巣癌を研究するための定量的ミトコンドリアプロテオミクス法を開発し、使用することであり、その分子ネットワーク変化は、系統的多項角11、12からの分子ネットワーク変化、これはミトコンドリア標的分子バイオマーカーの発見をもたらす予測、および卵巣癌患者のパーソナライズされた治療。相対および絶対定量のための等位タグ(iTRAQ)標識3、4は、ミトコンドリアタンパク質変化を定量する有効な方法である。ヒト卵巣癌および対照卵巣組織からの高品質のミトコンドリアサンプルの調製は、ミトコンドリアプロテオメ3のiTRAQ定量分析の前提条件である。iTRAQ定量プロテオミクスと組み合わせたミトコンドリア製剤は、ミトコンドリアプロテオーム基準マップ3の確立を含むヒト卵巣癌ミトコンドリアプロテオームに関する長期研究プログラムで成功しており、微分発現ミトコンドリアプロファイル4、14およびリン酸化を含む翻訳後修飾の分析は、すでに重要なシグナル経路の発見に至っているヒト卵巣癌におけるネットワーク変化5、エネルギー代謝4の変化を含む、脂質代謝、およびミトファジー経路系3。
これまでの研究では、密度勾配遠心分離と組み合わせた差動速度遠心分離は、ヒト卵巣癌からミトコンドリアを単離および精製し、卵巣組織3、4、5、14を制御する有効な方法である。iTRAQ標識と強いカチオン交換(SCX)-液体クロマトグラフィー(LC)-タンデム質量分析(MS/MS)は、調製されたミトコンドリアサンプルからタンパク質を検出、同定、定量するための重要な技術です。
ここでは、iTRAQ定量プロテオミクスと組み合わせたミトコンドリア調製のための詳細なプロトコルについて説明する。これらは、ヒト卵巣癌組織ミトコンドリアプロテオムの解析に正常に使用されている。プロトコルには、サンプルの調製、微分速度遠心分離、密度勾配遠心分離、ミトコンドリアサンプルの品質評価、トリプシンによるタンパク質消化、iTRAQ標識、SCX分画、LC、MS/MS、データベース検索、ミトコンドリアタンパク質の定量分析が含まれます。さらに、このプロトコルは、他のヒト組織ミトコンドリアプロテオメを分析するために容易に変換する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ミトコンドリアの変化は卵巣癌の特徴である。ヒト卵巣癌からの高品質なミトコンドリアサンプルの調製と大規模な定量プロテオミクスの対照組織は、卵巣癌病因におけるミトコンドリア機能の詳細な理解とミトコンドリア分子ネットワークの変化に利益をもたらし、ミトコンドリア4、5、8に基づく標的治療および有効なバイオマーカーの…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、湖南省百人タレントプラン(X.Z.)、仙陽病院人材紹介基金(XZ)、中国国立自然科学財団(Grant. 81572278およびXZ)、中国からの助成金「863」計画によって支えられました。プロジェクト(助成金番号2014AA020610-1からXZ)、中国湖南省自然科学財団(グラントNo.14JJ7008からXZ)。X.Z.は、本原稿の概念を考案し、ミトコンドリアサンプルのiTRAQ定量プロテオミクスデータを取得し、原稿を書いて改訂し、関連する作業を調整し、財務支援とそれに対応する責任を負った仕事。H.L.はミトコンドリアサンプルを調製した。SQ.は部分的な作業に参加しました。X.H.Zは英語の執筆と編集に参加しました。N.L.はiTRAQプロテオミクスデータを分析した。すべての著者は最終原稿を承認した。
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
References
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of “free radical diseases”. Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
