난소암 조직에서 미토콘드리아의 준비 및 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 난소 조직 제어
Summary
이 문서는 인간 난소 암 조직에서 미토콘드리아를 분리하고 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 난소 조직을 통제하기 위해 밀도 구배 원심분리와 함께 차동 속도 원심분리의 프로토콜을 제시합니다. 인간 난소암 미토콘드리아 프로테오메의 고품질 미토콘드리아 시료 및 높은 처리량 및 높은 재현성 정량적 프로테오믹스 분석의 결과.
Abstract
난소암은 사망률이 높지만 분자 메커니즘이 불분명한 일반적인 부인과 암입니다. 대부분의 난소암은 치료를 심각하게 방해하는 고급 단계에서 진단됩니다. 미토콘드리아 변화는 인간 난소암의 특징이며, 미토콘드리아는 에너지 대사, 세포 신호 및 산화 스트레스의 중심입니다. 난소암의 미토콘드리아 프로테오메의 변화에 대한 심층적인 통찰력은 난소암의 분자 메커니즘에 대한 심층적인 이해와 효과적이고 신뢰할 수 있는 바이오마커 및 치료 표적의 발견에 도움이 될 것입니다. 인간 난소암을 분석하고 미토콘드리아 프로테옴을 조절하기 위해 상대적 및 절대정량화(iTRAQ) 정량적 프로테오믹스를 위한 이소바릭 태그와 결합된 효과적인 미토콘드리아 제제 방법이 여기에 제시되고, 차동 속도 원심분리, 밀도 구배 원심분리, 미토콘드리아 시료의 품질 평가, 트립신을 함유한 단백질 소화, iTRAQ 라벨링, 강력한 양이온 교환 분획(SCX), 액체 크로마토그래피(LC), 탠덤 질량 분석법(MS/ MS), 데이터베이스 분석, 미토콘드리아 단백질의 정량분석. 많은 단백질은 인간 난소암 미토콘드리아 프로테오메의 커버리지를 최대화하고 인간 난소암에서 차별적으로 발현된 미토콘드리아 단백질 프로파일을 달성하기 위해 성공적으로 확인되었습니다.
Introduction
난소암은 사망률이 높지만 분자기전이 불분명한 흔한부인과암1,2. 난소암의 대부분은 심각하게 치료를 방해하는 고급 단계에서 진단됩니다. 미토콘드리아 변화는 인간 난소암의 특징이며, 미토콘드리아는 에너지 대사, 세포 신호, 산화 스트레스3, 4,5,6,7의중심이다. 난소암의 미토콘드리아 프로테오메의 변화에 대한 심층적인 통찰력은 난소암의 분자 메커니즘에 대한 심층적인 이해와 효과적이고 신뢰할 수 있는 바이오마커 및 치료 표적의 발견에 도움이 될 것입니다. 미토콘드리아 대사가 암 치료의 표적으로 제안되고 인식되고 있으며, 항미토콘드리아 요법은 궁극적으로 암의 재발 및 전이를 방지하는 데 매우 유익할 수 있다8. 개별 적인 대사 프로파일링은 또한 이미 암 계층화 및 예측 전략9,10에유용한 도구로 실행되고 있다.
이 연구의 장기적인 목표는 난소암과 대조군 난소 조직 사이의 미토콘드리아 프로테오메 변경을 명확히 하기 위한 난소암을 연구하기 위한 정량적 미토콘드리아 프로테오믹스 방법을 개발하고 사용하는 것입니다. 및 그들의 분자 네트워크 변화는 체계적인 다중 omics 각도11,12,이는 난소암의 분자 기전의 설명을 위한 미토콘드리아 표적 분자바이오마커(13)의 발견을 초래할 것이다, 난소암 환자의 맞춤형 치료. 상대적 및 절대 정량화(iTRAQ) 라벨링3,4에 대한 등음표는 미토콘드리아 단백질 변화를 정량화하는 효과적인 방법이다. 인간 난소암및 대조군 난소조직에서 고품질 미토콘드리아 시료의 제조는 미토콘드리아 프로테옴의 iTRAQ 정량 분석을 위한전제조건3. iTRAQ 정량 단백질과 결합된 미토콘드리아 제제는 미토콘드리아 단백질레고메 의 확립을 포함한 인간 난소암 미토콘드리아 프로테오메에 대한 장기 연구 프로그램에서 성공적으로 사용되어 왔으며, 미토콘드리아 단백질레오스 기준 맵3,미토콘드리아 프로파일의 분석은 미토콘드리아 프로파일4,14 및 포스포릴을 포함한 사후 번역 경로의 중요한 발견을 포함하고 있다. 인간 난소암의 네트워크 변화5,에너지 대사4,지질 대사 및 미토파지 경로 시스템3.
이전 연구는 밀도 구배 원심분리와 함께 차동 속도 원심분리가 인간 난소암으로부터 미토콘드리아를 분리및 정화하고 난소 조직을 조절하는 효과적인 방법인 것을발견했으며 3,4,5,14. 강력한 양이온 교환(SCX)-액체 크로마토그래피(LC)-탠덤 질량 분석법(MS/MS)과 결합된 iTRAQ 라벨링은 준비된 미토콘드리아 샘플의 단백질을 검출, 식별 및 정량화하는 핵심 기술입니다.
여기서, iTRAQ 정량적 프로테오믹스와 결합된 미토콘드리아 제제에 대한 상세한 프로토콜이 기재되어 있다. 이들은 인간 난소암 조직 미토콘드리아 프로테옴의 분석에 성공적으로 사용되어 왔다. 프로토콜은 샘플의 준비를 포함, 차동 속도 원심분리, 밀도 그라데이션 원심 분리, 미토콘드리아 샘플의 품질 평가, 트립신과 단백질 소화, iTRAQ 라벨링, SCX 분획, LC, MS / MS, 데이터베이스 검색, 및 미토콘드리아 단백질의 정량 분석. 더욱이, 이 프로토콜은 다른 인간 조직 미토콘드리아 프로테옴을 쉽게 분석하기 위해 번역한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미토콘드리아 변경은 난소암의 특징입니다. 인간 난소암에서 고품질의 미토콘드리아 시료를 제조하고 대규모 정량적 프로테오믹스에 대한 대조조직을 제조하여 난소암 발병기전 및 미토콘드리아 분자 네트워크 변화에 대한 미토콘드리아 기능에 대한 심층적인 이해를 돕고, 미토콘드리아4,8에기초한 표적 치료 및 효과적인 바이오마커의 후속 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 후난성 백 인재 계획(X.Z.), 시안야 병원 인재 소개 기금(XZ), 중국 국립 자연과학 재단(그랜트 81572278 및 XZ 81272798), 중국 “863” 계획의 보조금에 의해 지원되었습니다. 프로젝트 (그랜트 번호 2014AA020610-XZ), 중국의 후난 성 자연 과학 재단 (그랜트 번호 14JJ7008 에 XZ). X.Z.는 본 원고의 개념을 구상하고, 미토콘드리아 샘플의 iTRAQ 정량적 프로테오믹스 데이터를 획득하고, 원고를 작성 및 수정하고, 관련 작업을 조정하고, 재정 지원 및 대응에 대한 책임을 지었습니다. 작업. H.L. 미토콘드리아 샘플을 제조하였다. S.Q. 부분 작업에 참여했습니다. X.H.Z는 영어 쓰기 및 편집에 참여했습니다. N.L.은 iTRAQ 프로테오믹스 데이터를 분석했습니다. 모든 저자는 최종 원고를 승인했다.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
References
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of “free radical diseases”. Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
