Preparación de Mitocondrias a partir de tejidos de cáncer de ovario y tejidos ováricos de control para el análisis proteómico cuantitativo
Summary
Este artículo presenta un protocolo de centrifugación de velocidad diferencial en combinación con centrifugación de gradiente de densidad para separar las mitocondrias de los tejidos de cáncer de ovario humano y controlar los tejidos ováricos para el análisis proteómico cuantitativo, resultando en una muestra mitocondrial de alta calidad y un análisis proteómico cuantitativo de alta calidad y alta reproducibilidad de un proteomo mitocondrial de cáncer de ovario humano.
Abstract
El cáncer de ovario es un cáncer ginecológico común con alta mortalidad pero mecanismo molecular poco claro. La mayoría de los cánceres de ovario se diagnostican en la etapa avanzada, lo que dificulta gravemente la terapia. Los cambios mitocondriales son un sello distintivo de los cánceres de ovario humano, y las mitocondrias son los centros del metabolismo energético, la señalización celular y el estrés oxidativo. La comprensión en profundidad de los cambios del proteoma mitocondrial en los cánceres de ovario en comparación con el control del tejido ovárico beneficiará la comprensión profunda de los mecanismos moleculares del cáncer de ovario, y el descubrimiento de biomarcadores y dianas terapéuticas eficaces y confiables. Aquí se presenta un método eficaz de preparación mitocondrial junto con una etiqueta isobárica para la proteómica cuantitativa de cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) para analizar el cáncer de ovario humano y controlar los proteomes mitocondriales, incluyendo centrifugación de velocidad diferencial, centrifugación de gradiente de densidad, evaluación de la calidad de muestras mitocondriales, digestión proteica con trippsina, etiquetado iTRAQ, fraccionamiento de intercambio catiónico fuerte (SCX), cromatografía líquida (LC), espectrometría de masas en tándem (MS/ MS), análisis de bases de datos y análisis cuantitativo de proteínas mitocondriales. Muchas proteínas se han identificado con éxito para maximizar la cobertura del proteome mitocondrial del cáncer de ovario humano y para lograr el perfil de proteína mitocondrial expresado diferencialmente en cánceres de ovario humano.
Introduction
El cáncer de ovario es un cáncer ginecológico común con alta mortalidad pero mecanismo molecular poco claro1,2. La mayoría de los cánceres de ovario se diagnostican en la etapa avanzada, lo que dificulta seriamente la terapia. Los cambios mitocondriales son un sello distintivo de los cánceres de ovario humano, y las mitocondrias son los centros del metabolismo energético, la señalización celular y el estrés oxidativo3,4,5,6,7. La comprensión en profundidad de los cambios del proteoma mitocondrial en los cánceres de ovario en comparación con el control del tejido ovárico beneficiará la comprensión profunda de los mecanismos moleculares del cáncer de ovario, y el descubrimiento de biomarcadores y dianas terapéuticas eficaces y confiables. El metabolismo mitocondrial ha sido propuesto y reconocido como un objetivo para la terapia contra el cáncer, y la terapia antimitocondrial podría ser en última instancia muy beneficiosa para prevenir la recurrencia y metástasis del cáncer8. El perfilado metabólico individual también se practica como una herramienta útil para la estratificación del cáncer y las estrategias predictivas9,10.
El objetivo a largo plazo de esta investigación es desarrollar y utilizar un método proteomico mitocondrial cuantitativo cuantitativo para estudiar el cáncer de ovario para aclarar las alteraciones del proteomo mitocondrial entre el cáncer de ovario y controlar los tejidos ováricos, y sus alteraciones de la red molecular desde un ángulo multiémico sistemático11,12, que dará lugar al descubrimiento de biomarcadores moleculares dirigidos a las mitocondrias13 para la clarificación de los mecanismos moleculares del cáncer de ovario, predicción y tratamiento personalizado de los pacientes con cáncer de ovario. Las etiquetas isobáricas para la cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) etiquetado3,4 son un método eficaz para cuantificar los cambios de proteína mitocondrial. La preparación de muestras mitocondriales de alta calidad a partir de cáncer de ovario humano y tejidos ováricos de control son el requisito previo para el análisis cuantitativo iTRAQ de proteomos mitocondriales3. La preparación mitocondrial junto con la proteómica cuantitativa iTRAQ se ha utilizado con éxito en programas de investigación a largo plazo sobre el proteomo mitocondrial del cáncer de ovario humano, incluyendo el establecimiento de mapas de referencia del proteome mitocondrial3, el análisis de perfiles mitocondriales expresados diferencialmente4,14 y modificaciones post-traduccionales, incluida la fosforilación, que ya ha dado lugar al descubrimiento de importantes vías de señalización cambios en la red en los cánceres de ovario humano5, incluyendo alteraciones en el metabolismo energético4, metabolismo de los lípidos, y sistemas de vía mitophagia3.
Estudios anteriores han encontrado que la centrifugación de velocidad diferencial en combinación con centrifugación de gradiente de densidad es un método eficaz para aislar y purificar las mitocondrias del cáncer de ovario humano y controlar los tejidos ováricos3,4,5,14. El etiquetado iTRAQ junto con un fuerte intercambio catiónico (SCX)-cromatografía líquida (LC) espectrometría de masas tándem (MS/MS) es la técnica clave para detectar, identificar y cuantificar las proteínas de las muestras mitocondriales preparadas.
Aquí se describen protocolos detallados para la preparación mitocondrial junto con proteómica cuantitativa iTRAQ. Estos se han utilizado con éxito en el análisis de los proteomes mitocondriales del tejido de cáncer de ovario humano. Los protocolos incluyen preparación de muestras, centrifugación de velocidad diferencial, centrifugación de gradiente de densidad, evaluación de la calidad de muestras mitocondriales, digestión de proteínas con trippsina, etiquetado iTRAQ, fraccionamiento SCX, LC, MS/MS, búsqueda de bases de datos y análisis cuantitativo de proteínas mitocondriales. Además, este protocolo se traduce fácilmente para analizar otros proteomas mitocondriales de tejido humano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las alteraciones mitocondriales son un sello distintivo del cáncer de ovario. La preparación de muestras mitocondriales de alta calidad a partir de cáncer de ovario humano y tejidos de control para la proteómica cuantitativa a gran escala benefician la comprensión en profundidad de la función mitocondrial en la patogénesis del cáncer de ovario y los cambios en la red molecular mitocondrial, y ayudan a aclarar su mecanismo molecular para el posterior descubrimiento de la terapia diana y biomarcadores eficaces basa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Hunan Provincial Hundred Talent Plan (a X.Z.), los Fondos del Hospital Xiangya para la Introducción al Talento (a XZ), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81572278 y 81272798 a XZ), las subvenciones de China “863” Plan Plan (Concesión No 2014AA020610-1 a XZ), y la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Hunan de China (Subvención No 14JJ7008 a XZ). X.Z. concibió el concepto para el presente manuscrito, obtuvo los datos proteómicos cuantitativos iTRAQ de muestras de mitocondrias, escribió y revisó el manuscrito, coordinó el trabajo pertinente y fue responsable del apoyo financiero y el correspondiente Trabajo. Muestras de mitocondrias preparadas por H.L. S.Q. participó en trabajos parciales. X.H.Z participó en la escritura y editó el idioma inglés. N.L. analizó los datos de proteómica iTRAQ. Todos los autores aprobaron el manuscrito final.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
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