Isolamento e coltura di Oculomotor, Trochlear, e MotoNeuroni Spinali da Prenatal Islmn:GFP Topi Transgenici
Summary
Questo lavoro presenta un protocollo per produrre colture cellulari omogenee dei motoneuroni primari oculomotori, trocleari e spinali. Queste colture possono essere utilizzate per analisi comparative delle caratteristiche morfologiche, cellulari, molecolari ed elettrofisiologiche dei motoneuroni oculari e spinali.
Abstract
I neuroni oculomotori (CN3) e i neuroni trocleari (CN4) mostrano una notevole resistenza alle malattie dei motoneuroni degenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) rispetto ai motoneuroni spinali (SMN). La capacità di isolare e coltura mouse primario CN3s, CN4s, e SMN fornirebbe un approccio allo studio dei meccanismi alla base di questa vulnerabilità selettiva. Ad oggi, la maggior parte dei protocolli utilizza colture cellulari eterogenee, che possono confondere l’interpretazione dei risultati sperimentali. Per ridurre al minimo i problemi associati alle popolazioni di cellule miste, le colture pure sono indispensabili. Qui, il primo protocollo descrive in dettaglio come purificare e coltivare in modo efficiente i CN3/CN4 insieme alle controparti SMN dagli stessi embrionali usando embrioni del giorno 11.5 (E11.5) IslMN:GFP embrionali di topo transgenici. Il protocollo fornisce dettagli sulla dissezione e dissociazione dei tessuti, l’isolamento cellulare basato su FACS e la coltivazione in vitro di cellule dai nuclei CN3/CN4 e SMN. Questo protocollo aggiunge un nuovo sistema di coltura in vitro CN3/CN4 ai protocolli esistenti e fornisce contemporaneamente una cultura SMN pura e abbinata all’età per il confronto. Le analisi incentrate sulle caratteristiche morfologiche, cellulari, molecolari ed elettrofisiologiche dei motoneuroni sono realizzabili in questo sistema di coltura. Questo protocollo consentirà la ricerca sui meccanismi che definiscono lo sviluppo del motoneurone, la vulnerabilità selettiva e la malattia.
Introduction
La coltura dei motoneuroni primari è un potente strumento che consente lo studio dello sviluppo neuronale, funzione, e suscettibilità a fattori di stress esogeni. Le colture di motoneuroni sono particolarmente utili per lo studio di malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)1,2, i cui meccanismi di malattia sono incompleti. È interessante notare che, nonostante la significativa morte cellulare dei motoneuroni spinali (SMN) sia nei pazienti affetti da SLA che nei topi modello di SLA, la morte cellulare nei neuroni oculomotori (CN3) e i neuroni trocleari (CN4) sono relativamente scarsi1,3,4,5,6,7,8,9. Pertanto, analisi comparative delle colture pure di CN3/CN4 e SM potrebbero fornire importanti indizi sui meccanismi alla base della vulnerabilità relativa. Sfortunatamente, un ostacolo importante a tali analisi è stata l’incapacità di coltivare colture purificate di questi motoneuroni.
Molti protocolli sono stati descritti per la purificazione delle sinistenzioni da modelli animali. La maggior parte di questi protocolli utilizza tecniche di panning di smistamento delle cellule basate su media di densità10,11,12 e/o p75NTR-anticorpi -anticorpi- base alle tecniche di panning13,14,15,16. La centrifugazione del gradiente di densità sfrutta le dimensioni maggiori delle snn rispetto ad altre cellule spinali, mentre p75NTR è una proteina extracellulare espressa esclusivamente dalle sren nel midollo spinale. Quasi 100% culture SMN pure sono state generate da uno o entrambi questi protocolli11,12,14. Tuttavia, questi protocolli non sono riusciti a generare impostazioni cultura CN3/CN4 perché i CN3/CN4 non esprimono p75NTRe non sono stati identificati altri marcatori CN3/CN4 specifici. Sono anche più piccole delle smin e, pertanto, più difficili da isolare in base alle dimensioni. Invece, studi in vitro di CN3 o CN4 si sono affidati a dissociati17,18 ,19,20,21, espianto17,22,23,24,25,26, e fetta27,28 culture, che sono composti da tipi di cellule eterogenee, e nessun protocollo sono esistiti per il isolamento e cultura dei CN3 primari o CN4.
In questo caso, viene descritto un protocollo per la visualizzazione, l’isolamento, la purificazione e la coltivazione di CN3, CN4 e SMN dello stesso giorno embrionale 11.5 (E11.5) IslMN:GFP topi transgenici29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP etichetta specificamente i motoneuroni con un GFP farnesillato che si localizza nella membrana cellulare. Questo protocollo consente il confronto di diversi tipi di motoneuroni per chiarire i meccanismi patologici nella malattia dei motoneuroni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Storicamente, gli studi in vitro dei motoneuroni CN3 e/o CN4 si sono affidati a culture eterogenee come dissociate17,18,19,20,21, espiantare17,22,23,24,25,26e tagl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) per l’istruzione nelle tecniche di dissezione SMN; il Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, il Centro di Citometry di flusso della divisione immunologia della Harvard Medical School, il Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women’s Hospital Flow Cytometry Core e il Boston Children’s Hospital Flow Cytometry Research Facility per l’isolamento FACS dei motovini primari; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, membri del laboratorio Engle aggiuntivi e membri del consorzio Project ALS per assistenza tecnica e discussione ponderata. Questo studio è stato sostenuto dal Progetto SLA. Inoltre, R.F. è stato finanziato dalla Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad e dalla NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748; J.J. è stato supportato dal programma di formazione NIH/NEI nelle basi molecolari delle malattie oculari (5T32EY007145-16) attraverso lo Schepens Eye Research Institute e lo Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) attraverso il Boston Children’s Hospital; M.C.W è stato supportato da NEI (5K08EY027850) e Children’s Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); e E.C.E. è un investigatore dell’Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | – | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | – | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7ml Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | – | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | – | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
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