Изоляция и культура Oculomotor, Trochlear, и спинного моторного нейронов от пренатальной Islmn:GFP Трансгенных мышей
Summary
Эта работа представляет протокол для получения однородных клеточных культур первичных окуломоторных, трохлеевых и спинномозговых моторных нейронов. Эти культуры могут быть использованы для сравнительного анализа морфологических, клеточных, молекулярных и электрофизиологических характеристик глазных и спинальных моторных нейронов.
Abstract
Oculomotor нейронов (CN3s) и trochlear нейронов (CN4s) проявляют замечательную устойчивость к дегенеративным двигательных нейронов заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS) по сравнению с спинномозговой двигательных нейронов (SMNs). Способность изолировать и культуры первичной мыши CN3s, CN4s и SMNs обеспечит подход к изучению механизмов, лежащих в основе этой селективной уязвимости. На сегодняшний день в большинстве протоколов используются разнородные клеточные культуры, которые могут спутать интерпретацию экспериментальных исходов. Чтобы свести к минимуму проблемы, связанные со смешанными популяциями, необходимы чистые культуры. Здесь, первый протокол описывает подробно, как эффективно очищать и культивировать CN3s / CN4s наряду с коллегами SMNs из тех же эмбрионов, используя эмбриональный день 11.5 (E11.5) IslMN:GFP трансгенных эмбрионов мыши. Протокол содержит подробную информацию о вскрытии и диссоциации тканей, изоляции клеток на основе FACS и культивировании клеток CN3/CN4 и SMN. Этот протокол добавляет новую систему культуры in vitro CN3/CN4 к существующим протоколам и одновременно обеспечивает для сравнения чистую культуру SMN, соответствующую видам и возрасту. Анализы, посвященные морфологическим, клеточным, молекулярным и электрофизиологическим характеристикам моторных нейронов, осуществимы в этой культурной системе. Этот протокол позволит исследовать механизмы, определяющие развитие моторных нейронов, селективную уязвимость и болезни.
Introduction
Культура первичных моторных нейронов является мощным инструментом, который позволяет изучать развитие нейронов, функции и восприимчивость к экзогенным стрессам. Двигательные культуры нейронов особенно полезны для изучения нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS)1,2, чьи механизмы заболевания не полностью поняты. Интересно, что, несмотря на значительную гибель клеток спинномозговых моторных нейронов (SMNs) в обоих больных ALS и ALS модели мышей, гибель клеток в окуломоторных нейронов (CN3s) и trochlear нейронов (CN4s) являются относительно скудными1,3,4,5,6,7,8,9. Таким образом, сравнительный анализ чистых культур CN3s/CN4s и SMNs может дать важные подсказки о механизмах, лежащих в основе относительной уязвимости. К сожалению, основным препятствием для таких анализов является неспособность выращивать очищенные культуры этих моторных нейронов.
Было описано много протоколов для очистки SMNs от моделей животных. Большинство из этих протоколов использовать градиент плотности центрифугации10,11,12 и / или p75NTR-антителаоснове клеточной сортировки методов13,14,15,16. Центрифугация градиента плотности использует больший размер SMNs по сравнению с другими спинномозговыми клетками, в то время как p75NTR является внеклеточным белком, выраженным исключительно SMNs в спинном мозге. Почти 100% чистые культуры SMN были созданы одним или обоими из этих протоколов11,12,14. Тем не менее, эти протоколы не были успешными в создании CN3/CN4 культур, потому что CN3s/ CN4s не выражают p75NTR, и другие конкретные маркеры CN3/CN4 не были определены. Они также меньше, чем SMNs и, следовательно, труднее изолировать на основе размера. Вместо этого, в пробирке исследования CN3s или CN4s опирались на разъединенных17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26 , и ломтик27,28 культур, которые состоят из неоднородных типов клеток, и никаких протоколов не существовало для изоляции и культуры первичных CN3s или CN4s.
Здесь описывается протокол для визуализации, изоляции, очищения и культивирования CN3s, CN4s и SMNs с того же эмбрионального дня 11.5 (E11.5) IslMN:GFP трансгенных мышей29 (Рисунок 1, Рисунок 2A). IslMN:GFP специально маркирует моторные нейроны фарнезилатным GFP, который локализуется к клеточной мембране. Этот протокол позволяет видов и возрастных сравнения нескольких типов моторных нейронов для того, чтобы выяснить патологические механизмы в двигательных нейронов болезни.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исторически, в пробирке исследования CN3 и / или CN4 моторных нейронов опирались на неоднородные культуры, такие как разобщенные17,18,19,20,21, explant17,22,23,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Брижит Петтманн (Biogen, Cambridge, MA, США) за обучение методам вскрытия SMN; Дана Фарбер Институт рака Поток цитометрии фонда, иммунологии Отдел потока цитометрии фонда Гарвардской медицинской школы, Джослин Диабет центр потока Цитометрия Core, Бригам и женская больница Поток Цитометрия Core, и Бостон Детская больница Поток Цитометрии научно-исследовательский центр для FACS изоляции первичных моторных нейронов; А.А. Ньюджент, А.П. Тенни, А.С. Ли, Э.Х. Нгуен, М.Ф. Роуз, дополнительные члены лаборатории Энгл и члены консорциума Project ALS для технической помощи и вдумчивого обсуждения. Это исследование было поддержано проектом ALS. Кроме того, R.F. финансировалась Японским фондом сердца/Байером Якухиным Исследовательским грантом за рубежом и грантом NIH Training в области генетики T32 GM007748; JJ была поддержана NIH/ NEI учебной программы в молекулярных баз глазных заболеваний (5T32EY007145-16) через Schepens глаз научно-исследовательский институт и развития неврологии Учебная программа Постдокторской стипендий (5T32NS007473-19) через Бостонскую детскую больницу; M.C.W была поддержана NEI (5K08EY027850) и Детским больничным офтальмологией (Премия открытия факультета); и E.C.E. является Говард Хьюз медицинский институт следователь.
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | – | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | – | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7ml Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | – | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | – | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. 발생학. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G., Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
