Økende holdbarhet av dissosierte nevrale cellekulturer ved bruk av biologisk aktiv korallinmatriks
Summary
Dissociert hippocampus cellekultur er et sentralt eksperimentelt verktøy i nevrovitenskap. Nevral celleoverlevelse og funksjon i kultur forbedres når korallskjeletter brukes som matriser, på grunn av deres nevrobeskyttende og nevromodulative roller. Derfor viser nevrale celler dyrket på korallmatriks høyere holdbarhet, og er dermed mer tilstrekkelige for dyrking.
Abstract
Kulturer av dissosierte hippocampus-, nevron- og gliaceller er en verdifull eksperimentell modell for å studere nevral vekst og funksjon ved å gi høy celleisolasjon og et kontrollert miljø. Imidlertid er overlevelsen av hippocampusceller in vitro kompromittert: de fleste celler dør i løpet av den første uken av kulturen. Det er derfor av stor betydning å identifisere måter å øke holdbarheten til nevrale celler i kultur.
Kalsiumkarbonat i form av krystallinsk aragonitt avledet fra skjelettet av koraller kan brukes som en overlegen, aktiv matrise for nevrale kulturer. Ved å pleie, beskytte og aktivere gliaceller forbedrer korallskjelettet overlevelsen og veksten av disse cellene in vitro bedre enn andre matriser.
Denne protokollen beskriver en metode for å dyrke hippocampusceller på en korallmatrise. Denne matrisen genereres ved å feste korn av korallskjeletter til kulturretter, kolber og glassdeksler. Kornene hjelper til med å forbedre miljøet i cellene ved å introdusere dem til et fint tredimensjonalt (3D) miljø for å vokse på og danne vevlignende strukturer. 3D-miljøet introdusert av korallskjelettet kan optimaliseres for cellene ved sliping, noe som muliggjør kontroll over kornets størrelse og tetthet (dvs. matriksruheten), en egenskap som har vist seg å påvirke glialcelleaktiviteten. Videre gjør bruken av korn observasjon og analyse av kulturen enklere, spesielt ved bruk av lysmikroskopi. Derfor inneholder protokollen prosedyrer for generering og optimalisering av korallinmatrisen som et verktøy for å forbedre vedlikehold og funksjonalitet av nevrale celler in vitro.
Introduction
Kulturer av dissosierte nevrale celler, i dette tilfellet hippocampusceller, er en verdifull eksperimentell modell for å studere nevral vekst og funksjon ved å gi høy celleisolasjon og tilgjengelighet 1,2,3. Denne typen kultur brukes ofte i nevrovitenskap, stoffutvikling og vevsteknikk på grunn av den store mengden informasjon som kan samles inn, for eksempel veksthastighet og levedyktighet, nevrotoksisitet, nevrittutvekst og nettverk, synaptisk tilkobling og plastisitet, morfologiske modifikasjoner, nevrittorganisasjon og ledninger, etc.1,4,5,6,7.
Til tross for kulturens betydning, blir de kultiverte cellene vanligvis tvunget til å vokse på glassdeksel i et todimensjonalt monolag. Disse strenge miljømodifikasjonene reduserer signifikant nevrale cellers evne til å overleve over tid, fordi glassdeksler er ikke-nærende substrater med lav vedheftstyrke, og viser en lavere kapasitet til å støtte cellevekst 8,9,10,11.
Fordi dyrkede nevrale celler blir tvunget til å vokse under utfordrende forhold, vil en viktig tilnærming for å forbedre overlevelsen være å etterligne sitt naturlige miljø så mye som mulig12,13. Dette kan oppnås ved å bruke biomaterialer som vil fungere som matriser og etterligne den ekstracellulære matrisen til cellene, slik at de kan danne en vevlignende struktur og bistå i næring14.
Bruken av biomaterialer er en lovende tilnærming til å forbedre cellekulturer, fordi de fungerer som biokompatible stillas, gir mekanisk stabilitet og forbedrer en rekke celleegenskaper, inkludert vedheft, overlevelse, spredning, migrasjon, morfogenese og differensiering15,16,17. Flere typer biomaterialer brukes til å forbedre forholdene til cellene in vitro. Blant dem er biopolymerer, eller biologiske komponenter som vanligvis er en del av den ekstracellulære matrisen av cellene. Disse biomaterialene brukes mest som en form for polymeriserte beleggmidler eller hydrogeler18,19,20. På den ene siden gir matrisene nevnt ovenfor cellene et kjent 3D-miljø å vokse i, oppmuntre deres vedheft til parabolen og gi dem mekanisk støtte21,22. På den annen side forstyrrer deres polymeriserte form og innesperring av cellene i hydrogeler cellens tilgang til pleiende komponenter som er tilstede i vekstmediet, og gjør også oppfølgingen av cellene ved mikroskopiske metoder vanskeligere23.
Koralleksoskjeletter er biologiske marine-opprinnelsesmatriser. De er laget av kalsiumkarbonat, har mekanisk stabilitet og er biologisk nedbrytbare. Tidligere studier som bruker korallskjelettet som matrise for dyrking av nevrale celler i kultur har vist mye større vedheft, sammenlignet med glassdeksler24,25. I tillegg demonstrerte nevrale celler dyrket på korallskjelett sin evne til å innta kalsiumet skjelettet består av, som beskytter nevrale celler under forhold med næringsmangel26. Videre er korallskjelettet en støttende og nærende matrise som øker overlevelsen av nevrale celler, oppfordrer dannelsen av nevrale nettverk, øker graden av synaptisk tilkobling og muliggjør dannelsen av vevlignende strukturer27,28. Nylige studier har også vist at overflatetopografien til korallskjelettmatrisen spiller en avgjørende rolle i distribusjonen og aktiveringen av gliaceller 8,29. Korallskjelett er også effektivt som matrise for dyrking av andre celletyper, for eksempel osteocytter30,31, hepatocytter og kardiomyocytter i kultur (upubliserte data).
Derfor er korallskjelett en lovende matrise for dyrking av celler in vitro. Dermed beskriver protokollen beskrevet nedenfor teknikken for å dyrke nevrale celler på korallskjelett for å produsere mer stabile og velstående nevrale kulturer enn de som oppnås ved eksisterende metoder. Denne protokollen kan også være nyttig for dyrking av kardiomyocytter, hepatocytter og andre celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknikken som presenteres her beskriver en måte å forbedre vedlikehold og funksjonalitet av nevrale celler i kultur. Dette oppnås ved å feste cellene til en matrise laget av korallskjelettkorn som nærer cellene og fremmer deres vekst og aktivitet. Ved hjelp av denne teknikken øker kapasiteten til nevralkulturmodellen for å etterligne cellenes miljø i hjernen.
Innføringen av matrisen som et kultursubstrat har flere fordeler i forhold til andre substrater som brukes i klassiske nevrale …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Kamin-programmet til det israelske handels- og arbeidsdepartementet og av Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, USA.
Materials
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L – glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
References
- Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
- Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
- Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
- Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
- Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
- Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
- Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O’Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
- Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
- Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
- Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
- Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
- Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
- Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
- Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
- Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
- Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), 045005 (2019).
- Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
- Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
- Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- . Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019)
- Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
- Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
- Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
- Morad, T. . CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , (2019).
- Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).
