نموذج سرطان الجلد المستحث بالمواد الكيميائية باستخدام ثنائي ميثيل بنز [a] انثراسين و 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-خلات (دمبا-طن سنويا)
Summary
ويسبب سرطان الجلد مرحلتين من قبل اثنين من المواد الكيميائية التطبيقية موضعيا. الطفرات 7 ، 12-ديميثيلبنز [a] انثراسين) يسبب طفرات في خلايا البشرة والتطبيق المستمر لمشجع النمو العام 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-خلات يسرع تكوين الورم الحليمي الجلد.
Abstract
السرطان هو واحد من الامراض البشرية الأكثر تدميرا. نماذج السرطان التجريبية مهمة للحصول علي نظره ثاقبه في التفاعل المعقد لأنواع الخلايا المختلفة والجينات في تعزيز تطور الورم وتوفير منصة لاختبار فعاليه النهج العلاجية المختلفة. واحده من الأكثر شيوعا النماذج السرطانية التهابيه التجريبية هو نموذج DMBA-طن سنويا سرطان الجلد مرحلتين. يتم الحث علي تشكيل الورم في هذا النموذج من قبل التطبيق الموضعي لاثنين من المواد الكيميائية المختلفة ، 7 ، 12-ديميثيلبنز [a] انثراسين (دمبا) و 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-خلات (طن سنويا) ، التي تسبب معا تشكيل الحليمات في الجلد. وبما ان النتيجة الاوليه هي تشكيل الورم الحليمي في الجلد ، فان النموذج هو طريقه مثاليه وموثوقه وقابله للتكرار لمعالجه كل من بدء الورم (بقاء الورم خاليا من الأورام) وتقدم الورم (عدد وحجم الأورام المرئية). وتنتقل اثار العلاج DMBA-طن سنويا عن طريق اليه التهابيه ، مما يجعل هذا النموذج مناسبه خاصه لدراسة دور الجهاز المناعي في تشكيل الورم. ومع ذلك ، يقتصر هذا النموذج علي الجلد والأسطح الأخرى حيث يمكن تطبيق المواد الكيميائية علي. يتم توفير بروتوكول مفصل في هذه المقالة لاستخدام النموذج بنجاح.
Introduction
السرطان هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة في العالم. ولذلك ، هناك طلب لتطوير نماذج الامراض التجريبية الموثوقه للحصول علي فهم أفضل للمرض ، وكذلك لاستكشاف النهج العلاجية المحتملة. واحده من الأكثر استخداما التجريبية في نماذج فيفو لدراسة التنمية سرطان الجلد هو المستحثة كيميائيا الجلد مرحلتين السرطانية نموذج1,2. يوفر النموذج أداه لدراسة بدء الورم ، والترقية ، والتقدم بالاضافه إلى احداث محدده مثل تسلل الخلايا المناعية وتولد الاوعيه.
لاستخدام نموذج سرطان الجلد علي مرحلتين ، يتم التعامل مع الجلد الخلفي من الفئران مع اثنين من المواد الكيميائية المختلفة التي تحفز معا تشكيل الورم. ويبدا النموذج مع جرعه منخفضه من الطفرة ، DMBA ، تليها التعرض لفترات طويلة لمروج الورم ، طن سنويا3 (الشكل 1). Dmba المطاوع الحمض النووي عشوائيا عن طريق تشكيل القناات المختلطة مع الحمض النووي للخلايا البشرة والخلايا الجذعية الكيراتينيه الاوليه4,5,6,7. بعض من هذه الطفرات العشوائية تجري في الجينات بروتو ، مثل Hras1 (الطفرات في Kras و Nras يتم الكشف عنها أيضا) وتحويل الجينات بروتو إلى الجينات يدفع تشكيل الورم تحت المحفزات المناسبة. طن سنويا, في المقابل, هو الأكثر شيوعا الورم الأكثر استخداما عامل تعزيز النمو. هدفه جزيئيه بروتين [كيناز] [ك] ([بكك])8. كما ينشط طن سنويا Wnt/β-catenin الإشارات التي هي حاسمه لتشكيل الورم في النموذج9. التعرض المتكرر والمطول لعامل تعزيز يؤدي إلى تعزيز الإشارات الخلية ، وزيادة إنتاج عوامل النمو ، ورد فعل التهابي المحلية ، والتي هي واضحة بسبب زيادة تخليق الحمض النووي وتسلل الخلايا التهابيه في الجلد المعالج.
وقد تم تحديد الوسطاء التهابيه الرئيسية في نموذج DMBA-طن سنويا10. Interleukin-17a (آيل-17a) ومن المعروف ان التورم بشكل خاص في dmba-طن سنويا نموذج11,12. هو يعمل في تازر مع [اينترليوكين] 6 ([آيل-6]) ويساهم في [بلبلج] و [العدلات] تعيين13,14. الاضافه إلى ذلك ، وقد أظهرت الخلاياالتائية و العدلات ان تكون توتوريغينيك في نموذج DMBA-طن سنويا. أخيرا, الضامة يستطيع أيضا روجت [توتوريجينيسيس] في النموذج15,16,17.
خلال مرحله الترقية ، يتم تعزيز تكاثر الخلايا المتحولة ويتم الحفاظ علي فرط تنسج البشرة1. وهذا يؤدي إلى نمو الورم الحليمي في الجلد في 10 – 20 أسابيع ، وبعد ذلك تبدا الورم الحليمي لتحويل إلى الأورام الخبيثة ، سرطان الخلايا الحرشفية (SCCs)2. ومع ذلك, اقل من 10% من الورم الحليمي التقدم إلى الخبيثة, علي الرغم من ان هذه النسبة المئوية تعتمد أيضا علي الخلفية الوراثية للفئران2,18. علي مدي عقود لم يكن معروفا ما هو نوع من الخلايا في البداية تحور في الأورام التي تؤدي إلى خباثة ، علي الرغم من ان بعض الدراسات قد أبلغت عن ميزات واضحة متميزة في الأورام الخبيثة بالمقارنة مع الحليمات الحميدة19،20. ومع ذلك, وقد زادت الدراسات الاخيره إلى حد كبير فهمنا علي الأصل النسيلي من تشكيل الورم في dmba-طن سنويا نموذج21. 22-الآن 23. وقد ثبت ان كلا من الخلايا الظهاريه المستمدة من نخاع العظم والخلايا الجذعية بصيلات الشعر تسهم في تشكيل الورم22. وكشفت الدراسات المتعلقة بالسلالات الخاصة بمرحله محدده ان الحليمات الحميدة هي من أصل أحادي ، لكنها تجند السكان الجدد من الخلايا الظهاريه21،23. ومع ذلك ، واحد فقط من الخلايا المستنسخة يعمل كسائق للسرطان. انه يحتوي علي طفرة Hras23. ويرتبط التقدم لتشكيل سرطان مع اكتساح النسيلي23.
و DMBA مسرطنه يبدا تشكيل الورم الحليمي و طن سنويا يعزز نمو الورم. التالي ، يمكن دراسة بدء الورم بشكل منفصل عن الترقية عن طريق مقاطعه التجربة قبل فتره العلاج طن سنويا. كما يتم دراسة تطور الورم أسبوعيا فانه يوفر فرصه كبيره لتحليل مفصل نمو الورم في جميع انحاء الدراسة. لان الأورام يتم إنشاؤها بواسطة المواد الكيميائية الخارجية ، وطفرة اونكوغينيك في جرثومي غير ضروري. التالي ، فان دراسة اثار الخلفية الجينية (علي سبيل المثال ، الضربة القاضية/الجينات مقابل النوع البري) علي الأورام السرطانية هي مباشره2. وباختصار ، فان نموذج سرطان الجلد DMBA/طن سنويا هو نهج مفيد بشكل خاص لدراسة دور الجهاز المناعي في تطور الورم وكذلك لتقييم بدء الورم والخطوات الترويجية بشكل مستقل أو اينتردبندنتلي.
الشكل 1: DMBA-طن سنويا-الجلد الناجم عن نموذج سرطان المخطط التفصيلي. يتم تطبيق DMBA مسرطنه موضعيا للحث علي طفرات الحمض النووي في مرحله البدء من النموذج. يتم أداره النمو-تعزيز وكيل طن سنويا 2x في الأسبوع لتعزيز تكاثر الخلايا خلال مرحله الترقية ، مما يؤدي إلى تطوير الأورام الحليمة في الجلد. يتم التضحية بالماشية بعد ان تصل استجابه الورم الحليمي إلى هضبة ، عاده في غضون أسابيع 15 – 20 ، اعتمادا علي الخلفية الجينية للفئران. يمكن لنسبه صغيره من الورم الحليمي ان تتطور إلى SCCs في غضون 20 – 50 أسبوعا. لدراسة الاحداث المبكرة في مرحله البدء والترقية المبكرة ، يمكن جمع العينات (علي سبيل المثال ، بعد فتره وجيزة من تطبيق طن سنويا الثاني). صوره تمثيليه و هيوسين و ايزين المقطع العرضي الملون من الورم الحليمي علي جلد الماوس C57BL/6 بعد 19 أسابيع من العلاج تظهر. شريط مقياس = 0.1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
DMBA-سنويا-الناجمة عن سرطان الجلد هي واحده من نماذج السرطان الأكثر استخداما لأنها قابله للاستنساخ للغاية ويوفر معلومات عن تطور الورم من البدء إلى الأورام الخبيثة. قياس النتائج الرئيسية ، تكوين الورم الحليمي ، هو الكمية بسهوله وموثوقيه. يعالج النموذج كلا من بدء الورم (بقاء الورم خاليا) والتق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل اكاديميه فنلندا (المنح 25013080481 و 25013142041 (I.J.) ، 286377 و 295814 (عضو البرلمان) ، 287907 (تي جي)) ، ومؤسسه Päivikki و Sakari Sohlberg (عضو البرلمان ، تي جي) ، والمؤسسة الطبية الفنلندية (T.P.) ، والبحوث الحكومية التنافسية تمويل منطقه مسؤوليه الخبراء في مستشفي جامعه تامبيري (منحه 9V049 و 9V049 (عضو البرلمان) ، 9V049 و 9V049 (تي جي)) ، وتمويل البحوث الحكومية التنافسية لمجال مسؤوليه الخبراء في مختبرات فيلاب (منحه X51409 (I.J.)) ، Tays مؤسسه الدعم (I.J. ، عضو البرلمان ، تي جي) ، مؤسسه تامبيري للسل (I.J. ، عضو البرلمان ، تي جي) ، المؤسسة الثقافية الفنلندية (سفينة) ، مؤسسه باولو (T.P.) ، جمعيه السرطان في فنلندا (عضو البرلمان) ، ومؤسسه اميل علتونين (T.P.).
Materials
| 1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill | Starlab | S1182-1730-C | |
| 300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill | Starlab | S1180-9710-C | |
| 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) | Sigma | D3254-100MG | Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light. |
| Acetone | Sigma | 1000141011 | Evaporates rapidly and is inflammable. |
| Attane vet 1000 mg/g | Piramal Critical Care Limited | Liquid isoflurane for inhalation | |
| Battery-Operated Clipper Isis | Albert Kerlb GmbH | GT421 | For shaving the fur |
| CONTRAfluran-Restgasfilter | ZeoSys GmbH | For anesthesia | |
| Linex Nature N1030 Ruler 30 cm | Staples Business Advantage | 60383 | For measuring papillomas |
| Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm – Red | VetTech Solutions Ltd | AN045AR | For sacrifice |
| Mekasoft | Mekalasi | 23008 | Table cover |
| Mice (Balb/c JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Mice (C57BL/6JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera | Panasonic | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | For histology samples |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) | Enzo | BML-PE160-0001 | |
| Precision balance PLJ-C/PLJ-G | KERN & SOHN GmbH | PLJ 600-3CM | |
| Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing | VetTech Solutions Ltd | AN044BX | For sacrifice |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | For nucleic acid samples |
| Tacta pipette 100-1000 ul | Sartorius | LH-729070 | |
| Tacta pipette 20-200 ul | Sartorius | LH-729060 | |
| UNO Anaesthetic Key Filler | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Face Mask for Mouse | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO FM2200 Flowmeter | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Gas Exhaust Unit | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Induction Box | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO200VAP Vaporizer | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia |
References
- DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
- Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
- Perez-Losada, J., Balmain, A. Stem-cell hierarchy in skin cancer. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 434-443 (2003).
- Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
- Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
- Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
- Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
- Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
- Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
- Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
- Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. 암 연구학. 70 (24), 10112-10120 (2010).
- He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
- Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
- Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
- Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. 암 연구학. 68 (10), 3924-3930 (2008).
- Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
- Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. 암 연구학. 53 (20), 4803-4810 (1993).
- Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
- Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
- Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, 400-409 (2015).
- Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
- Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
- Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
- Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
- Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
- Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
- May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
- Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
- Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
- Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
- Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
- Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. 암 연구학. 39 (4), 1293-1297 (1979).
- Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. 암 연구학. 40, 4352-4355 (1980).
- Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
- Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
- Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
- Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
- Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454 (7203), 436-444 (2008).
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
- Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
- Day, C. -. P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).
