Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

Maria V&#228;h&#228;tupa; Toini Pemmari; Ilkka Junttila; Marko Pesu; Tero  A.H. J&#228;rvinen

doi:10.3791/60445

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

암 연구학

Kemisk-inducerad hud carcinogenes modell med Dimetylbenz [a] antracen och 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-acetat (DMBA-TPA)

Published: December 19, 2019

doi:

10.3791/60445

Maria Vähätupa*¹, Toini Pemmari*¹, Ilkka Junttila², Marko Pesu², Tero A.H. Järvinen

¹Faculty of Medicine and Health Technology,Tampere University and Tampere University Hospital, ²Department of Clinical Microbiology,Fimlab Laboratories

Summary

Två-stegs hud cancerogenesen induceras av två topikalt applicerade kemikalier. En mutagen 7, 12-dimetylbenz [a] antracen) orsakar mutationer i epidermala celler och en kontinuerlig tillämpning av allmän tillväxt stimulator 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat accelererar hudpapillom formation.

Abstract

Cancer är en av de mest förödande mänskliga sjukdomarna. Experimentella cancer modeller är viktiga för att få insikt i det komplexa samspelet mellan olika celltyper och gener för att främja tumörprogression och för att tillhandahålla en plattform för att testa effekten av olika terapeutiska metoder. En av de mest använda experimentella inflammatoriska cancer modeller är DMBA-TPA två-stegs hud carcinogenes modell. Tumör bildning induceras i denna modell av topikal applicering av två olika kemikalier, 7, 12-dimetylbenz [a] antracen (DMBA) och 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA), som tillsammans orsakar papillom bildas i huden. Eftersom det primära resultatet är papillom bildning i huden, modellen är en idealisk, pålitlig, och reproducerbara sätt att ta itu med både tumör initiering (tumör-fri överlevnad) och tumör progression (antal och storlek av synliga tumörer). Effekterna av DMBA-TPA-behandling överförs via en inflammatorisk mekanism, vilket gör denna modell särskilt lämplig för att studera immunsystemets roll i tumör bildning. Denna modell är dock begränsad till huden och andra ytor där kemikalierna kan appliceras på. Ett detaljerat protokoll finns i den här artikeln för att använda modellen med lyckat resultat.

Introduction

Cancer är en av de främsta dödsorsakerna i världen. Därför finns det en efterfrågan att utveckla pålitliga experimentella sjukdomsmodeller för att få en bättre förståelse av sjukdomen samt att utforska potentiella terapeutiska metoder. En av de mest använda experimentella in vivo-modellerna för att studera hudcancer utveckling är den kemiskt inducerade tvåstegs hud cancerogenesen Model^1,2^. Modellen ger ett verktyg för att studera tumör initiering, befordran, och progression utöver specifika händelser såsom immun cell infiltration och angiogenes.

För att använda två-stegs hud carcinogenes modell, ryggen huden på möss behandlas med två olika kemikalier som tillsammans inducera tumör bildning. Modellen inleds med en låg dos av mutagen, DMBA, följt av långvarig exponering för tumörpromotorn, TPA³ (figur 1). Dmba muterar DNA slumpmässigt genom att bilda kovalenta addukter med DNA från epidermala celler och primära keratinocyter stamceller⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Några av dessa slumpmässiga mutationer äger rum i en proto-Onkogene, såsom Hras1 (mutationer i kras och de nationella regleringsmyndigheterna upptäcks också) och omvandlingen av proto-onkogener till onkogener driver tumörbildningen under rätt stimuli. TPA, i sin tur, är den mest använda tumörtillväxt främjande agent. Dess molekylära mål är proteinkinas C (PKC)⁸. TPA aktiverar också WNT/β-catenin signalering som är avgörande för tumör bildning i modell⁹. Upprepad och långvarig exponering för att främja agenten leder till förbättrad cellsignalering, ökad produktion av tillväxtfaktorer, och en lokal inflammatorisk reaktion, som är uppenbara på grund av ökad DNA-syntes och inflammatorisk cell infiltration i den behandlade huden.

De viktigaste inflammatoriska mediatorerna i DMBA-TPA-modellen har identifierats¹⁰. Interleukin-17a (Il-17a) är känd för att vara särskilt tumorigen i dmba-TPA-modellen¹¹^,¹². Det fungerar i samverkan med interleukin 6 (IL-6) och deltar i makrofagen och neutrofila rekrytering¹³^,¹⁴. Dessutom, CD4⁺ T-celler och neutrofiler har visat sig vara tumörframkallande i dmba-TPA-modellen. Slutligen kan makrofager också främja uppkomst i modellen¹⁵^,¹⁶^,¹⁷.

Under främjande fasen, cell spridningen av muterade celler förstärks och en ihållande hyperplasi i epidermis upprätthålls¹. Detta leder till papillom utveckling i huden i 10 – 20 veckor, varefter papillom börjar konvertera till maligna tumörer, skivepitelcancer cell karcinom (SCCS)². Emellertid, mindre än 10% av papillom framsteg till malignitet, även om denna procentsats beror också på den genetiska bakgrunden av möss²^,¹⁸. I årtionden var det inte känt vilken typ av celler var initialt muterade i tumörer som leder till malignitet, även om vissa studier hade rapporterat klart distinkta funktioner i maligna tumörer jämfört med benign papillom¹⁹^,²⁰. Emellertid, nyare studier har kraftigt ökat vår förståelse för det klonala ursprunget av tumör bildning i DMBA-TPA modell²¹^. ²²^. ²³. det visades att både benmärg-härledda epitelceller och hårfollikelstamceller bidrar till tumörbildningen²². Stage-specifika härstamning studier har avslöjat att godartade papillom är av monoklonal ursprung, men de rekrytera nya epitelceller populationer²¹^,²³. Men endast en av cell klonerna fungerar som en drivkraft för carcinogenes; den innehåller en HRAS-mutation²³. Progressionen till carcinom bildas är förknippad med en klon svep²³.

Cancerframkallande dmba initierar papillom bildandet och TPA främjar tumörtillväxt. Därför, tumören initiering kan studeras separat från befordran genom att avbryta experimentet innan TPA behandlingsperioden. Som tumörprogression studeras veckovis det erbjuder en stor möjlighet för detaljerad tumörtillväxt analys under hela studien. Eftersom tumörerna genereras av externa kemikalier, är en onkogen mutation i köns cells onödigt. Således, studera effekterna av en genetisk bakgrund (t. ex. knockout/Transgene vs Wild typ) på uppkomst är enkel². Sammanfattningsvis är DMBA/TPA hudcancer modell en särskilt användbar metod för att studera rollen av immunförsvaret i tumörprogression samt för utvärderingen av tumör initiering och främjande steg självständigt eller beroende.

Figur 1: DMBA-TPA-inducerad hud carcinogenes modell kontur. Det carcinogena DMBA appliceras lokalt för att inducera DNA-mutationer i inledningsskedet av modellen. Den tillväxtbefrämjande agent TPA administreras 2x en vecka för att öka cellproliferation under främjande fasen, vilket leder till utvecklingen av papillom i huden. Djur offras efter papillom svar når en platå, vanligtvis inom veckor 15 – 20, beroende på den genetiska bakgrunden av möss. En liten del av papillom kan vidareutvecklas till SCCs inom 20 – 50 veckor. För att studera tidiga händelser i inledningen och tidig befordran fas, prover kan samlas in (t. ex., strax efter den andra TPA ansökan). Ett representativt fotografi och hematoxylin och eosin färgade tvärsnitt av papillom på en C57BL/6 mus hud efter 19 veckors behandling visas. Scale bar = 0,1 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Det protokoll som beskrivs här har godkänts av Finlands nationella djur Etiknämnd (protokollnummer ESAVI/23659/2018). 1. försöksdjur, reagens och utrustning Använd ålder och kön matchade möss. Starta studien vid 7 – 9 veckors ålder, eftersom huden i de flesta möss är i telogen (vilofasen) runt den åldern2. Observera beteendet hos djuren under studien och om de slåss, som ofta händer med hanar, hus dem separat. Slagsmål kan orsaka ne…

Representative Results

Det huvudsakliga resultatet är överlevnad (dvs, papillom fri) tid mellan behandling eller genotyp grupper. Det sekundära utfallet är antalet papillom per vecka i varje grupp (figur 2). De förväntade resultaten är en statistiskt signifikant skillnad i papillom ledig tid och i antalet papillom mellan experimentella (två eller flera) grupper. Det rekommenderas att räkna antalet papillom och rita en kurva under befordran (TPA) fas för att få en uppfattning om skillnaderna mellan grupp…

Discussion

DMBA-TPA-inducerad hudcancer är en av de mest använda cancer modeller eftersom det är mycket reproducerbara och ger information om tumör progression från initiering till malignitet. Den viktigaste resultatmåttet, papillom formation, är lätt och tillförlitligt kvantitativ. Modellen behandlar både tumör initiering (tumör-fri överlevnad) och progression (tumör nummer och storlekar) samtidigt. Modellen lämpar sig för att studera olika föreningar, såsom potentiella Therapeutics, och effekterna av enskilda ge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete finansierades av Finlands Akademi (bidrag 25013080481 och 25013142041 (I.J.), 286377 och 295814 (M.P.), 287907 (tj)), Päivikki och Sakari Sohlberg Foundation (M.P., tj), finska Medical Foundation (T.P.), den konkurrensutsatta statliga forskningen Finansiering av expert ansvarsområdet vid Tammerfors universitetssjukhus (Grant 9V049 och 9X044 (M.P.), 9X011 och 9V010 (tj)), den konkurrensutsatta statliga forskningsfinansieringen av expert ansvarsområdet i Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), Tays Support Foundation (I.J., M.P., tj), Tampere tuberculosis Foundation (I.J., M.P., tj), Finlands Kulturstiftelse (M.V.), Paulo Foundation (T.P.), Cancer Society of Finland (M.P.) och stiftelsen Emil Aaltonen (T.P.).

Materials

1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill	Starlab	S1182-1730-C
300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill	Starlab	S1180-9710-C
7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)	Sigma	D3254-100MG	Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.
Acetone	Sigma	1000141011	Evaporates rapidly and is inflammable.
Attane vet 1000 mg/g	Piramal Critical Care Limited		Liquid isoflurane for inhalation
Battery-Operated Clipper Isis	Albert Kerlb GmbH	GT421	For shaving the fur
CONTRAfluran-Restgasfilter	ZeoSys GmbH		For anesthesia
Linex Nature N1030 Ruler 30 cm	Staples Business Advantage	60383	For measuring papillomas
Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm – Red	VetTech Solutions Ltd	AN045AR	For sacrifice
Mekasoft	Mekalasi	23008	Table cover
Mice (Balb/c JRj)	Janvier labs		Other strains also possible
Mice (C57BL/6JRj)	Janvier labs		Other strains also possible
Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera	Panasonic
Paraformaldehyde	Merck	30525-89-4	For histology samples
Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)	Enzo	BML-PE160-0001
Precision balance PLJ-C/PLJ-G	KERN & SOHN GmbH	PLJ 600-3CM
Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing	VetTech Solutions Ltd	AN044BX	For sacrifice
RNAlater	Qiagen	76104	For nucleic acid samples
Tacta pipette 100-1000 ul	Sartorius	LH-729070
Tacta pipette 20-200 ul	Sartorius	LH-729060
UNO Anaesthetic Key Filler	Scintica instrumentation inc.		For anesthesia
UNO Face Mask for Mouse	Scintica instrumentation inc.		For anesthesia
UNO FM2200 Flowmeter	Scintica instrumentation inc.		For anesthesia
UNO Gas Exhaust Unit	Scintica instrumentation inc.		For anesthesia
UNO Induction Box	Scintica instrumentation inc.		For anesthesia
UNO200VAP Vaporizer	Scintica instrumentation inc.		For anesthesia

References

DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
Perez-Losada, J., Balmain, A. Stem-cell hierarchy in skin cancer. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 434-443 (2003).
Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. 암 연구학. 70 (24), 10112-10120 (2010).
He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. 암 연구학. 68 (10), 3924-3930 (2008).
Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. 암 연구학. 53 (20), 4803-4810 (1993).
Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, 400-409 (2015).
Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. 암 연구학. 39 (4), 1293-1297 (1979).
Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. 암 연구학. 40, 4352-4355 (1980).
Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454 (7203), 436-444 (2008).
Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
Day, C. -. P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Vähätupa, M., Pemmari, T., Junttila, I., Pesu, M., Järvinen, T. A. Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA). J. Vis. Exp. (154), e60445, doi:10.3791/60445 (2019).