Två-stegs hud cancerogenesen induceras av två topikalt applicerade kemikalier. En mutagen 7, 12-dimetylbenz [a] antracen) orsakar mutationer i epidermala celler och en kontinuerlig tillämpning av allmän tillväxt stimulator 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat accelererar hudpapillom formation.
Cancer är en av de mest förödande mänskliga sjukdomarna. Experimentella cancer modeller är viktiga för att få insikt i det komplexa samspelet mellan olika celltyper och gener för att främja tumörprogression och för att tillhandahålla en plattform för att testa effekten av olika terapeutiska metoder. En av de mest använda experimentella inflammatoriska cancer modeller är DMBA-TPA två-stegs hud carcinogenes modell. Tumör bildning induceras i denna modell av topikal applicering av två olika kemikalier, 7, 12-dimetylbenz [a] antracen (DMBA) och 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA), som tillsammans orsakar papillom bildas i huden. Eftersom det primära resultatet är papillom bildning i huden, modellen är en idealisk, pålitlig, och reproducerbara sätt att ta itu med både tumör initiering (tumör-fri överlevnad) och tumör progression (antal och storlek av synliga tumörer). Effekterna av DMBA-TPA-behandling överförs via en inflammatorisk mekanism, vilket gör denna modell särskilt lämplig för att studera immunsystemets roll i tumör bildning. Denna modell är dock begränsad till huden och andra ytor där kemikalierna kan appliceras på. Ett detaljerat protokoll finns i den här artikeln för att använda modellen med lyckat resultat.
Cancer är en av de främsta dödsorsakerna i världen. Därför finns det en efterfrågan att utveckla pålitliga experimentella sjukdomsmodeller för att få en bättre förståelse av sjukdomen samt att utforska potentiella terapeutiska metoder. En av de mest använda experimentella in vivo-modellerna för att studera hudcancer utveckling är den kemiskt inducerade tvåstegs hud cancerogenesen Model1,2. Modellen ger ett verktyg för att studera tumör initiering, befordran, och progression utöver specifika händelser såsom immun cell infiltration och angiogenes.
För att använda två-stegs hud carcinogenes modell, ryggen huden på möss behandlas med två olika kemikalier som tillsammans inducera tumör bildning. Modellen inleds med en låg dos av mutagen, DMBA, följt av långvarig exponering för tumörpromotorn, TPA3 (figur 1). Dmba muterar DNA slumpmässigt genom att bilda kovalenta addukter med DNA från epidermala celler och primära keratinocyter stamceller4,5,6,7. Några av dessa slumpmässiga mutationer äger rum i en proto-Onkogene, såsom Hras1 (mutationer i kras och de nationella regleringsmyndigheterna upptäcks också) och omvandlingen av proto-onkogener till onkogener driver tumörbildningen under rätt stimuli. TPA, i sin tur, är den mest använda tumörtillväxt främjande agent. Dess molekylära mål är proteinkinas C (PKC)8. TPA aktiverar också WNT/β-catenin signalering som är avgörande för tumör bildning i modell9. Upprepad och långvarig exponering för att främja agenten leder till förbättrad cellsignalering, ökad produktion av tillväxtfaktorer, och en lokal inflammatorisk reaktion, som är uppenbara på grund av ökad DNA-syntes och inflammatorisk cell infiltration i den behandlade huden.
De viktigaste inflammatoriska mediatorerna i DMBA-TPA-modellen har identifierats10. Interleukin-17a (Il-17a) är känd för att vara särskilt tumorigen i dmba-TPA-modellen11,12. Det fungerar i samverkan med interleukin 6 (IL-6) och deltar i makrofagen och neutrofila rekrytering13,14. Dessutom, CD4+ T-celler och neutrofiler har visat sig vara tumörframkallande i dmba-TPA-modellen. Slutligen kan makrofager också främja uppkomst i modellen15,16,17.
Under främjande fasen, cell spridningen av muterade celler förstärks och en ihållande hyperplasi i epidermis upprätthålls1. Detta leder till papillom utveckling i huden i 10 – 20 veckor, varefter papillom börjar konvertera till maligna tumörer, skivepitelcancer cell karcinom (SCCS)2. Emellertid, mindre än 10% av papillom framsteg till malignitet, även om denna procentsats beror också på den genetiska bakgrunden av möss2,18. I årtionden var det inte känt vilken typ av celler var initialt muterade i tumörer som leder till malignitet, även om vissa studier hade rapporterat klart distinkta funktioner i maligna tumörer jämfört med benign papillom19,20. Emellertid, nyare studier har kraftigt ökat vår förståelse för det klonala ursprunget av tumör bildning i DMBA-TPA modell21. 22. 23. det visades att både benmärg-härledda epitelceller och hårfollikelstamceller bidrar till tumörbildningen22. Stage-specifika härstamning studier har avslöjat att godartade papillom är av monoklonal ursprung, men de rekrytera nya epitelceller populationer21,23. Men endast en av cell klonerna fungerar som en drivkraft för carcinogenes; den innehåller en HRAS-mutation23. Progressionen till carcinom bildas är förknippad med en klon svep23.
Cancerframkallande dmba initierar papillom bildandet och TPA främjar tumörtillväxt. Därför, tumören initiering kan studeras separat från befordran genom att avbryta experimentet innan TPA behandlingsperioden. Som tumörprogression studeras veckovis det erbjuder en stor möjlighet för detaljerad tumörtillväxt analys under hela studien. Eftersom tumörerna genereras av externa kemikalier, är en onkogen mutation i köns cells onödigt. Således, studera effekterna av en genetisk bakgrund (t. ex. knockout/Transgene vs Wild typ) på uppkomst är enkel2. Sammanfattningsvis är DMBA/TPA hudcancer modell en särskilt användbar metod för att studera rollen av immunförsvaret i tumörprogression samt för utvärderingen av tumör initiering och främjande steg självständigt eller beroende.
Figur 1: DMBA-TPA-inducerad hud carcinogenes modell kontur. Det carcinogena DMBA appliceras lokalt för att inducera DNA-mutationer i inledningsskedet av modellen. Den tillväxtbefrämjande agent TPA administreras 2x en vecka för att öka cellproliferation under främjande fasen, vilket leder till utvecklingen av papillom i huden. Djur offras efter papillom svar når en platå, vanligtvis inom veckor 15 – 20, beroende på den genetiska bakgrunden av möss. En liten del av papillom kan vidareutvecklas till SCCs inom 20 – 50 veckor. För att studera tidiga händelser i inledningen och tidig befordran fas, prover kan samlas in (t. ex., strax efter den andra TPA ansökan). Ett representativt fotografi och hematoxylin och eosin färgade tvärsnitt av papillom på en C57BL/6 mus hud efter 19 veckors behandling visas. Scale bar = 0,1 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
DMBA-TPA-inducerad hudcancer är en av de mest använda cancer modeller eftersom det är mycket reproducerbara och ger information om tumör progression från initiering till malignitet. Den viktigaste resultatmåttet, papillom formation, är lätt och tillförlitligt kvantitativ. Modellen behandlar både tumör initiering (tumör-fri överlevnad) och progression (tumör nummer och storlekar) samtidigt. Modellen lämpar sig för att studera olika föreningar, såsom potentiella Therapeutics, och effekterna av enskilda ge…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av Finlands Akademi (bidrag 25013080481 och 25013142041 (I.J.), 286377 och 295814 (M.P.), 287907 (tj)), Päivikki och Sakari Sohlberg Foundation (M.P., tj), finska Medical Foundation (T.P.), den konkurrensutsatta statliga forskningen Finansiering av expert ansvarsområdet vid Tammerfors universitetssjukhus (Grant 9V049 och 9X044 (M.P.), 9X011 och 9V010 (tj)), den konkurrensutsatta statliga forskningsfinansieringen av expert ansvarsområdet i Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), Tays Support Foundation (I.J., M.P., tj), Tampere tuberculosis Foundation (I.J., M.P., tj), Finlands Kulturstiftelse (M.V.), Paulo Foundation (T.P.), Cancer Society of Finland (M.P.) och stiftelsen Emil Aaltonen (T.P.).
1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill | Starlab | S1182-1730-C | |
300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill | Starlab | S1180-9710-C | |
7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) | Sigma | D3254-100MG | Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light. |
Acetone | Sigma | 1000141011 | Evaporates rapidly and is inflammable. |
Attane vet 1000 mg/g | Piramal Critical Care Limited | Liquid isoflurane for inhalation | |
Battery-Operated Clipper Isis | Albert Kerlb GmbH | GT421 | For shaving the fur |
CONTRAfluran-Restgasfilter | ZeoSys GmbH | For anesthesia | |
Linex Nature N1030 Ruler 30 cm | Staples Business Advantage | 60383 | For measuring papillomas |
Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm – Red | VetTech Solutions Ltd | AN045AR | For sacrifice |
Mekasoft | Mekalasi | 23008 | Table cover |
Mice (Balb/c JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
Mice (C57BL/6JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera | Panasonic | ||
Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | For histology samples |
Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) | Enzo | BML-PE160-0001 | |
Precision balance PLJ-C/PLJ-G | KERN & SOHN GmbH | PLJ 600-3CM | |
Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing | VetTech Solutions Ltd | AN044BX | For sacrifice |
RNAlater | Qiagen | 76104 | For nucleic acid samples |
Tacta pipette 100-1000 ul | Sartorius | LH-729070 | |
Tacta pipette 20-200 ul | Sartorius | LH-729060 | |
UNO Anaesthetic Key Filler | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
UNO Face Mask for Mouse | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
UNO FM2200 Flowmeter | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
UNO Gas Exhaust Unit | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
UNO Induction Box | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
UNO200VAP Vaporizer | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia |